Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем<em> Coxiella burnetii</em> Во время миРНК Глушащий

Coxiella burnetii является уникальным внутриклеточным патогеном , который вызывает зоонозных инфицирования человека вирусом лихорадки Ку. Это заболевание связано с широким спектром клинических проявлений , простирающихся от бессимптомной сероконверсией к угрожающей жизни хронической инфекции , которая часто проявляется как эндокардит лет после облучения ^1. Человек заражение происходит в основном за счет вдыхания загрязненных аэрозолей с жвачных Главным резервуаром инфекции, в частности, молочных коров, овец и коз. Хотя Coxiella инфекция у этих животных , как правило , субклинический, инфекция может вызвать аборт , и значительная бактериальной нагрузки в родильном жидкости и плаценты может сильно повредить окружающей среде ^1. Примером огромное бремя такого загрязнения может иметь на недавно наблюдался как общественного здравоохранения и промышленности сельского хозяйства в Q лихорадки вспышки, произошедшей в Нидерландах ^2. Между 2007 и2010, более 4000 случаев заболевания людей лихорадкой Ку был поставлен диагноз , и эта вспышка была связана со значительным загрязнением козьих ферм ^3. Кроме того, Coxiella является потенциальным биологическим оружием, по классификации Центров США по контролю и профилактике заболеваний, в связи с экологической устойчивости бактерий и низкой инфекционной дозы , необходимой для возникновения серьезных заболеваемости и смертности ^4.

Coxiella существует в двух фазах: Фаза I организмы, выделенные из природных источников, являются чрезвычайно вирулентных и фазовые организмы II являются сильно ослаблена в естественных условиях. Например, после того, как несколько в пробирке пассажей Coxiella burnetii Девять Миля этап I организмов, бактерии II фазы были получены , которые содержат необратимые хромосомные делеции что приводит к укороченной липополисахарида (LPS) ^5. Этот штамм, C. burnetii NMII, фенотипически подобна фазе I в моделях тканевой культуры и обеспечивает более безопасный режимл для исследователей для изучения Coxiella патогенеза в лабораториях ^5. В последние годы некоторые прорывы быстро продвигались поле Coxiella генетики. В частности, развитие аксенными сред (подкисленной цитрат цистеина среда – ACCM-2) позволил рост клеток , свободных от Coxiella как в жидком , так и на твердых средах ^6,7. Это привело к улучшению прямых генетических инструментов , доступных для Coxiella включая индуцибельной системы экспрессии генов, челночных векторов и случайных систем транспозонов ^8-11. Совсем недавно, два способа целевой инактивации генов были также разработаны, проложив путь для изучения кандидатов ¹² генов вирулентности конкретных.

После интернализации альвеолярными макрофагами, Coxiella размножается до высоких цифр в мембраносвязанного отсек называется Coxiella- содержащий вакуоли (CCV). ККТ требует незаконного оборота хост эндоцитических-йгрубые ранние и поздние эндосомы , пока она не созревает в лизосом происхождения органелл ^13. На протяжении всего этого процесса, ККТ приобретает факторы хозяина , которые либо появляются скоротечно или остаются связанными с вакуоль, в том числе, но не ограничиваясь ими, Rab5, Rab7, CD63 и LAMP-1 ^13-15. Репликация Coxiella внутри клеток – хозяев полностью зависит от полностью функциональной Dot / Icm Тип системы IVB секрецией (T4SS) ^8,16,17. Эта система секреции является многослойной структуры белка праязыка , связанные с системами конъюгации и охватывает как бактериальные и вакуолярной мембраны для доставки бактериальные белки, называемые эффекторы, в цитоплазме хозяина ^18. Coxiella T4SS функционально очень похож на хорошо охарактеризован тип IVB Dot / Icm секрецией системы легионелл ^19,20. Интересно отметить , что активация эффекторной транслокации T4SS и последующее не происходит до тех пор , пока не достигнет Coxiella кислой лизосомы , производныйорганеллы, приблизительно 8 ч после инфицирования ^17,21. На сегодняшний день более 130 Dot / ИВМ эффекторы были идентифицированы ^9,17,22-24. Многие из этих эффекторов , вероятно , играют важную роль в процессе репликации Coxiella внутри клеток – хозяев; Тем не менее, лишь немногие эффекторы были функционально характеризуется ^25-29.

В данном исследовании мы используем анализ транслокации флуоресценции на основе , которая опирается на расщепления субстрата CCF2-AM FRET (далее в качестве субстрата Бламу) через β-лактамазы активности в цитоплазме клетки – хозяина (рис 1). Интересующий ген слит с TEM-1 бета-лактамазы (Бламу) на репортерной плазмидой, которая обеспечивает конститутивную экспрессию. Субстрат Бламу состоит из двух флуорофоров (кумарин и флуоресцеин), которые образуют пару разъедать. Возбуждение результатов кумарина в ладу флуоресцеина и зеленого флуоресцентного излучения в отсутствие эффекторных транслокации; Тем не менее, если Дву-M-эффектор слитый белок транслоцируется в цитоплазме хозяина, в результате β-лактамазы расщепляет деятельности по β-лактам кольцо подложки Бламу, отделяя пары FRET по производству синего флуоресцентное излучение при возбуждении. Этот анализ транслокация было хорошо зарекомендовала себя как подход к идентификации эффекторных белков из ряда различных внутриклеточных и внеклеточных бактерий, в том числе С. burnetii, Л. pneumophila, Л. longbeachae, хламидиоза, энтеропатогенные Е. палочка, сальмонелла и Brucella ^17,30-35.

Для определения роли конкретных факторов хозяина на Coxiella эффекторной транслокации мы используем устоявшийся метод молчанием генов , известного как РНК – интерференции, в частности малых интерферирующих РНК (миРНК). Первоначально определены в Caenorhabditis Элеганс, РНК – интерференция является сохраняющимся эндогенный клеточный процесс , используемый для врожденной оборNSE от вирусов, а также регуляции генов ^36,37. После связывания последовательности конкретных миРНК, деградация мРНК происходит через RISC (РНК-индуцированного глушителей комплекса) приводит к определенному молчанием генов или бросовой ^38. В этом исследовании миРНК был использован для целевой двух белков хозяина, Rab5A и Rab7A, которые являются важными регуляторами эндоцитотического пути. Влияние глушителей Rab5A и Rab7A на эффекторной транслокации было установлено с помощью С. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 был выбран , как это было показано ранее , транслоцироваться системой секреции Дот / Icm из Coxiella ^17.

Используя оба миРНК глушителей гена и fluorescencebased анализа транслокации , описанный здесь, мы начинаем установить роль факторов хозяина в транслокации эффекторных белков с помощью Coxiella. Такой подход может быть применен к широкому кругу обеих внутриклеточной и внеклеточной бактерий, которые обладают сходными secretioN системы, отвечающие за транслокацию эффекторных белков.