Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Endospores sont métaboliquement formes dormantes de bactéries qui permettent aux bactéries de persister dans des environnements défavorables. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, la formation de spores est induite par une carence en nutriments , mais ce processus peut être contrôlé par des changements à pH, l' exposition à l' oxygène ou d' autres contraintes ^1. Alors que dans leur forme de spores métaboliquement dormance, les bactéries résistent rayonnement UV, la dessiccation, des températures plus élevées, et le gel ^2. La plupart des connaissances sur le processus de sporulation provient d'études dans l'organisme modèle, Bacillus subtilis. Le processus de sporulation commence avec la réplication de l' ADN et la formation d'un filament de ^3,4 axiale. Un septum asymétrique divise ensuite la cellule en deux compartiments de taille inégale. Le grand compartiment, la cellule mère, engloutit plus petit compartiment, préspore. Tant la cellule mère et préspore coordonner l'expression des gènes à mûrir la spore et la cellule mère lyses finalement, libérant le dormant spores dans le milieu environnant ^1.

La structure des spores et la composition est conservée dans de nombreuses espèces bactériennes. Le noyau de spores a une teneur en eau inférieure à la cellule végétative et est riche en acide dipicolinique (DPA) ^1,2. Au cours de la formation de spores, le DPA est pompée dans le noyau de spores en échange de l'eau. Entourant le noyau est une membrane de spores intérieure où, dans la plupart des bactéries sporulantes, les récepteurs qui reconnaissent les petites molécules qui stimulent la germination germinants ⁽²⁾ sont situés. Situé juste en dehors de la membrane interne de la spore est une couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Une couche de peptidoglycane spécialisée (cortex) entoure le peptidoglycane de la paroi cellulaire et se compose d'un grand nombre des mêmes composants que le peptidoglycane de la paroi cellulaire [alternance N-acétylglucosamine (NAG) et de l'acide N-acétylmuramique (NAM)]. Toutefois, environ 50% des résidus non alignés dans le cortex ont été convertis en muramique-δ-lactame ^5,6 </sup>. Au cours de la germination des spores, ces résidus muramique-δ-lactame sont reconnus par les spores cortex enzymes lytiques (les SCLEs), permettant ainsi le cortex à dégrader (un processus essentiel pour achever la germination), mais pas de la paroi cellulaire. Autour du cortex est une membrane externe et plusieurs couches de protéines d'enveloppe ^2.

Contrôle du processus de germination est d'une importance cruciale pour les bactéries formant des spores. Germination est déclenchée lorsque les récepteurs de germination interagissent avec leurs germinants respectifs ^2. Dans de nombreuses bactéries formant des spores, ces plantules sont des acides aminés, des sucres, des nucléotides, des ions ou des combinaisons de ces ^deux. C. difficile la germination des spores est initiée par des combinaisons de certains acides biliaires, [par exemple, l' acide taurocholique (TA)] et des acides aminés (par exemple la glycine) , ^7-10. Bien qu'il existe des différences entre le C. voie de germination difficile et les voies étudiées dans d' autres sporuléedes bactéries telles que B. subtilis, commun à tous est l'exigence absolue de dégrader le cortex de spores pour permettre à une cellule végétative de croître à partir de la spore germée ^2,8. La dégradation de Cortex peut être accompli par le SCLEs CWLj / SLEB (que l'on trouve dans B. subtilis) ou SLEC (que l'on trouve dans de nombreux Clostridia). Cortex hydrolyse réduit la contrainte sur la paroi cellulaire et de la spore. Cela permet noyau pleine réhydratation, une étape nécessaire dans réactivant la plupart des protéines nécessaires pour le métabolisme cellulaire ^2.

Lorsque les spores germent, les spores dormantes passe d'un état de phase lumineuse à un état de phase sombre et ce processus peut être mesurée par un changement de densité optique (DO) à 600 ¹¹ nm. Un précédent rapport suggère qu'une grande partie de ce changement de OD est due à la libération de DPA de la spore ^12. Au cours de notre étude récente, nous avons cherché à comparer le moment de C. difficile la germination des spores et la surveillancelibération de DPA et cortex fragments ^9. Pour cette étude, il était essentiel de surveiller la libération de fragments de cortex comme ils ont commencé à être libéré par la germination des spores.

Le dosage colorimétrique utilisé ici a été basé sur une méthode de détection des sucres avec des extrémités réductrices développé Ghuysen et al. ^13. Parce que d' autres ont décrit des protocoles pour la détection des sucres réducteurs ¹⁴ ou ont modifié les protocoles ^15, la littérature sur ce sujet peut être déroutant. Ici, nous détaillons une méthode étape par étape pour la détection colorimétrique de sucres réducteurs libérés de germant C. Les spores difficile. Bien que cette étude utilise C. Les spores difficile, les sucres réducteurs libérés au cours de la germination des spores provenant d' autres bactéries formant des spores puissent être détectées avec ce protocole ^9,16,17.