HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

L'adenosina (ADO) è un nucleoside purinico con una molecola di adenina attaccato ad una molecola di residuo di zucchero ribosio attraverso un legame glicosidico. Quando presenti nell'ambiente extracellulare, protegge le cellule da danni eccessivi dall'azione del sistema immunitario. Questo ruolo è stato evidenziato utilizzando diversi modelli di malattie, come la colite ^1, il diabete ^2, asma ^3, sepsi ⁴ e ⁵ danno ischemico. Una delle principali funzioni ADO è l'inibizione delle risposte immunitarie nel microambiente tumorale, contribuendo al tumore evasione immune ^6. Per questo motivo, i meccanismi coinvolti nella formazione ADO e segnalazione sono di notevole interesse terapeutico ^7.

i livelli di ADO nel microambiente tissutale sono relativamente bassi in condizioni fisiologiche normali e certamente al di sotto della soglia di sensibilità delle cellule immunitarie. Tuttavia, durante l'ipossia, ischemia, infiammazioni, infezioni, metabolichelo stress e la trasformazione tumorale che aumentano rapidamente ^8. Gli elevati livelli di ADO extracellulari in risposta a segnali di tessuto-perturbante hanno una doppia funzione: da segnalare lesioni dei tessuti in modo autocrino e paracrino e per generare le risposte del tessuto che possono essere visti in generale come cytoprotective.

Extracellulare ADO può essere formato attraverso una varietà di meccanismi, che comprendono il rilascio da compartimenti intracellulari mediati da trasportatori nucleosidici ⁹ o accumulo a causa del degrado compromessa gestito da adenosina deaminasi. La via principale che porta a un aumento dei livelli extracellulari ADO comporta l'azione di una cascata di ectonucleotidases, che sono associati a membrana ectoenzimi generano ADO phosphohydrolysis di nucleotidi rilasciati dalle cellule morte o morenti. Questo percorso procede attraverso l'azione sequenziale di CD39 (trifosfato ectonucleoside difosfoidrolasi-1) che converte extracellulare adenosina 5'-trifosfato (ATP) o adenosina 5'-difosfato (ADP) di adenosina 5'-monofosfato (AMP) e CD73 (5'-nucleotidasi), che converte AMP ad ADO ^10.

Extracellulare ADO suscita le sue risposte fisiologiche legandosi a quattro transmembrana ADO recettori, cioè A1, A2A, A2B e A3. Ogni recettore ha affinità diverse per ADO e distribuzione tissutale specifica. Tutti i recettori hanno sette domini transmembrana e sono accoppiati a proteine ​​G per intracellulari proteine ​​GTP-binding (proteine ​​G), che può indurre (proteina Gs) o inibire (Gi proteine) attività di ciclasi e, di conseguenza, la produzione di cAMP intracellulare. Pertanto, i cambiamenti nel citoplasmatica livelli di cAMP intracellulare impatto sulle attività della proteina chinasi durante risposte fisiologiche ^11. In condizioni fisiologiche ADO extracellulare è inferiore a 1 micron, che possono attivare indiscriminatamente A1, A2A e recettori A3. Tuttavia, l'attivazione di A2B sottotipo richiede notevolmente superioreconcentrazioni del nucleoside, quali quelli generati in condizioni fisiopatologiche. In alternativa, ADO extracellulare può essere degradata a inosina (INO) di adenosina deaminasi (ADA) e CD26, una proteina ADA complessante localizzazione ADA sulla superficie cellulare. Un'altra possibilità è che ADO è interiorizzato dalla cella attraverso i trasportatori equilibrativo nucleosidici (ENT) e fosforilata di AMP di ADO proteina chinasi ^12,13.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo analitico di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) quantificare in un'unica seduta AMP substrato e prodotti ADO e INO, come generato da linfociti umani. La nostra esperienza è stato inizialmente ottenuto con cellule di pazienti leucemia linfocitica cronica (CLL), che si caratterizzano per l'espansione di una popolazione matura di linfociti CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B che esprimono costitutivamente CD39 ^14,15. Abbiamo mostrato circa il 30%della LLC pazienti esprimono la ectoenzima CD73 e che questo fenotipo correla con una prognosi infausta ^16. Questa sottopopolazione di cellule leucemiche co-esprimono CD39 e CD73 può produrre attivamente ADO extracellulare da ADP e / o AMP. La preincubazione di cellule CD73 ⁺ CLL con α, β sintesi extracellulare ADO-metilene-ADP (APCP), un inibitore noto di CD73 attività enzimatica, blocca completamente confermando che CD73 rappresenta l'enzima strozzatura di tale cascade ^16.

cellule CLL esprimono anche ADA e l'ADA proteine ​​complessanti CD26, che sono responsabili per la conversione di ADO in INO. Utilizzando inibitori ADA specifici, come eritro-9- (2-idrossi-3-nonil) I wiadenine (EHNA) cloridrato e desossicoformicina (dCF), è possibile bloccare la degradazione ADO extracellulare in INO. Inoltre, pre-trattamento con un inibitore ADA in combinazione con dipiridamolo, che blocca trasportatori nucleosidici, aumenta l'accumulo di ADO nella cellasurnatanti.

Abbiamo poi esteso questo protocollo per le cellule derivate da altre stirpi, tra cui i linfociti T e cellule mieloidi, confermando la produzione ADO CD73-dipendente. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo HPLC è estremamente versatile e che può essere applicata a diverse linee cellulari e per diverse condizioni di coltura (Figura 1).

Figura 1. Rappresentazione schematica del meccanismo enzimatico responsabile della produzione ADO extracellulare. Adenosina 5'-trifosfato (ATP) e / o adenosina 5'-difosfato (ADP) può essere degradata per CD39 di adenosina 5'-monofosfato (AMP), che a sua volta viene convertito dal CD73 nella adenosina nucleoside (ADO). Una volta ADO viene prodotto nello spazio extracellulare, può rientrare cella attraverso i trasportatori nucleosidici (ORL), è convertito in inosina (INO) olegarsi a diversi tipi di recettori P1 ADO. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.