Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Nota: Los procedimientos para la clonación y la transformación del plásmido reportero de c-di-GMP purificada se discuten en otra parte 12. 1. Generación de GFP Etiquetado c-di-GMP Reportero P. La cepa aeruginosa Inocular 5 ml de caldo de lysogeny (LB) con una única colonia de P. aeruginosa e incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Transferencia de 2 ml de cultivo de una noche en 200 ml de medio LB fresco en un matraz de 1 L y se incuba a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Monitor de densidad óptica a 600 nm (OD 600) cada 30 min tomando una muestra de 1 ml del matraz y examinar utilizando un espectrofotómetro (como se describió anteriormente 12). Cuando el OD 600 alcanza entre 0,3 a 0,5, coloque 40 ml del cultivo en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Sedimentar las células por centrifugación a 8000 rpm durante 10 min a 4 ° C, descartar el sobrenadante y re-suspender las células en 40 ml de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa. Sedimentar las células una segunda vez mediante centrifugación tal como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 20 ml de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa. Sedimentar las células una última vez por centrifugación como se describe en el paso 1.5 y volver a suspender en 400 l de solución enfriada con hielo, estéril, 300 mM de sacarosa. Nota: La densidad de las células en este punto debe ser unidades formadoras de aproximadamente 1 x 10 11 colonias por mililitro (CFU / ml). Chill las células en hielo durante 30 min, después de lo cual están listos para la electroporación. Añadir 1 l de una solución plásmido pCdrA :: GFP C / l 0,2 mg de 12 a 40 l de P. células electro-competentes aeruginosa preparado anteriormente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que ha sido pre-enfriado en hielo. Mezclar la suspensión y transferir en un pre-refrigerado, 2 mm la distancia entre electrodos, cubeta de electroporación. Nota: pCdrA :: GFP </em> C: GFP pUCP22Not-P cdra -RBSII- (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, lo que da una lectura fluorescente del nivel intracelular de c-di-GMP en P. aeruginosa cepas, fue desarrollado y validado por Rybtke et al. 12. Eliminar la humedad en el exterior de la cubeta con papel de seda y colocar la cubeta en la cámara de muestra del electroporador. De impulsos con un voltaje de 2,5 kV, la capacitancia de 25 mF y la resistencia de 200 Ω. Retire la cubeta y añada 1 ml de medio LB. A continuación, transferir las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y se incuba durante 2 horas a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Spread 10 l, 50 l y 100 ml de alícuotas del cultivo en placas LB-agar estéril suplementado con ampicilina (a una concentración de 100 mg / ml), y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche. Confirmar la expresión de GFP (excitatien a 485 nm, emisión a 520 nm) mediante el examen de la placa bajo un microscopio de fluorescencia con un canal de GFP estándar y recoger una sola colonia para inocular 5 ml LB. Incubar toda la noche como se describe en el paso 1.1. Mezclar 0,5 ml del cultivo de una noche con 0,5 ml de glicerol al 50% en unos 2 ml tornillo tubo superior y se almacena a -80 ° C. 2. Preparación del cultivo iniciador para la inoculación Dos días antes de la pantalla, la placa de la P. cepa aeruginosa (que contiene el plásmido pCdrA :: gfp C) a partir de la -80 ° C de stock en una placa de LB-agar (suplementado con ampicilina a una concentración de 100 mg / ml) mediante la difusión de las bacterias suavemente sobre la placa utilizando una inoculación estéril lazo. Se incuba la placa durante la noche a 37 ° C. La noche antes de la proyección, inocula una sola colonia de P. aeruginosa de la placa en 10 ml de medio LB (suplementado con ampicilina a una concentración de 100 mg / ml) en un tuser y se incuba durante la noche el precultivo a 37 ° C con agitación a 200 rpm. En el día de la pantalla, preparar un subcultivo de la pre-cultivo de una noche diluyéndola primero con medio LB fresco hasta una DO 600 de 1,0 y luego diluir adicionalmente con 5% LB hasta una DO 600 de (relación 01:25) 0,04 . Nota: El volumen total del medio inoculado depende del número de placas a ensayar. 5% LB se hace mediante la dilución de 100% LB con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración requerida. Es importante destacar que, los medios de comunicación (5% LB) permite la activación constitutiva de pCdrA :: gfp C en P. aeruginosa. Añadir una barra de agitación magnética estéril en el recipiente y se agita la cultura a la velocidad mínima en un agitador magnético durante 30 min a temperatura ambiente, permitiendo que las bacterias se aclimate a los medios de comunicación antes de que se dispensan en placas de 384 pocillos. 3. Inoculación e incubación de las placas de 384 pocillos que contienenpequeñas moléculas Nota: Esterilidad y buenas técnicas asépticas son de suma importancia para los siguientes pasos. Para preparar el control positivo (100% de inhibición), añadir 20 l de tobramicina sulfato (25 mg / ml) a 10 ml (adecuado para un máximo de 12 placas) del subcultivo preparado en el Paso 2.3 y mezclar suavemente. Pipeta de 40 l de la cultura de control positivo en los pocillos A23 – P23 (Figura 2). Para preparar el control negativo (0% de inhibición), añadir 30 l de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adecuado para un máximo de 12 placas) de la subcultura preparado en el Paso 2.3 y mezclar suavemente. Pipeta de 40 l de la cultura de control negativo en los pocillos A24 – P24 (Figura 2). Para cada una de las placas estampadas con las pequeñas moléculas, inocular un volumen de 40 l de los cultivos de una noche diluidas (descritos en la etapa 2.3) en los pocillos A1 – P22 (Figura 2). Nota: Esto se puede lograr usando un manipulador de líquidos robAntiguo Testamento. Debido a las propiedades heterogéneas de cultivos de bacterias, es importante para mantener una agitación continua y de moderada a mantener las bacterias distribuidos sistemáticamente en los medios de comunicación, mientras que la dispensación. Para ello, sin dejar de remover la cultura aclimatadas desde el paso 2.4 magnéticamente durante la dispensación. Sellar las placas con un sello de la cubierta permeable al aire y se incuba durante 6 horas a 37 ° C. Nota: El sello permeable al aire es crítica para mantener las condiciones invariables a través de los 384 pozos y para evitar el posible desarrollo de gradientes de oxígeno a través de la placa. 4. Medición de crecimiento (OD 600) e intracelular Nivel GMP c-di-(GFP) Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, pre-calentar el lector de placas a 37 ° C para evitar la condensación. Retire con cuidado el sello de la cubierta permeable al aire antes de la lectura. Se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm con un calado de 10 parpadeos por bien yun tiempo de estabilización de 0,2 seg. Antes de medir la fluorescencia, hacer una ganancia automático y el ajuste focal basado en bien A24 (control negativo) y establecer el valor objetivo de ganancia en un 75% (Figura 2). Desde el software de control de lector de placas, haga clic en la medición de inicio y haga clic en el '' Focus y los ID / placa de ajuste de ganancia 'ficha'. Seleccionar '' Ajuste de foco '' y '' Canal A '' a la derecha de la ventana. Seleccionar '' Ajuste de ganancia '' y '' Selected así '', y el tipo de '' 75 '' como '' Valor objetivo ''. Por último, elegir bien A24 en el diseño de la placa antes de hacer clic en '' iniciar el ajuste ''. Una vez que el ajuste se lleva a cabo, haga clic en '' para iniciar la medición ''. Medir la fluorescencia de la GFP reportero en una máximos de excitación / emisión de 485/520 nm con un calado de 10 parpadeos por pozo y una settlitiempo ng de 0,2 seg. Recopilar datos de todas las placas examinadas. Nota: Las lecturas de datos se guardan automáticamente como predeterminado por el software de control de lector de placas. Ver lecturas haciendo clic en el icono de "Marte" dentro del software de control para abrir el paquete de análisis estadístico. Recuperar datos de "doble clic" en el número de placa de interés para acceder a los datos para el análisis. Análisis 5. Datos Evaluar la uniformidad y reproducibilidad del ensayo utilizando un análisis sólido z ', que es la métrica de calidad más comunes reportados para pantallas de alto rendimiento. Calcular z robusta 'utilizando la fórmula: Cuando MAD (Median absoluto de desviación) es una estimación de la desviación estándar, p es el control positivo (100% de inhibición) y n es el control negativo (0% de inhibición) para los dos OD 600 y GFP valores. Nota: Un ensayo con un "valor z robusta (calculado para tanto OD 600 y GFP de datos en bruto) mayor que o igual a 0,5 se considera como un excelente ensayo. Calcular el% de inhibición del crecimiento utilizando la fórmula: Donde Xi es la DO600 iterada valor de DO 600 de cada pocillo de muestra. % De inhibición OD600> 0, inhibidor del crecimiento; % De inhibición OD600 <0, promotor de crecimiento. Evaluar el% de inhibición del nivel intracelular de c-di-GMP mediante la fórmula (el cambio en unidades de intensidad de fluorescencia arbitraria se corrigen para el cambio en la densidad celular): Donde Xi es el valor de GFP GFP iterativa de cada pocillo de muestra. % De inhibición GFP> 0, inhibidor de c-di-GMP; % y# 160; Inhibición GFP <0, el promotor c-di-GMP. Establecer un umbral para la detección de colisiones a las 3 MAD de la mediana (mediana ± 3 MAD), calculado a partir de la muestra así leer-outs de cada placa, asumiendo una distribución normal de los puntos de datos. Nota: Sin embargo, un ± 50% de inhibición de corte puede ser seleccionado para los ensayos de respuesta a la dosis más reproducibles y precisos si es necesario.