הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em> Pseudomonas aeruginosa</em

הערה: נהלי שיבוט וטרנספורמציה של פלסמיד הכתב המטוהר ג-di-GMP הם דנו במקום אחר 12. הדור 1. של GFP Tagged ג-di-GMP Reporter פ זני aeruginosa לחסן 5 מ"ל של מרק lysogeny (LB) בינוני עם מושבה אחת של פ aeruginosa ו דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד. העברת 2 מ"ל של תרבות הלילה לתוך 200 מ"ל של מדיום LB טרי בבקבוק 1 ליטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. צג צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) כל 30 דקות על ידי נטילת דגימה 1 מ"ל מהבקבוק ולבחון באמצעות ספקטרופוטומטר (כמתואר 12 בעבר). כאשר OD 600 מגיע בין 0.3 – 0.5, להציב 40 מ"ל של תרבות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 8000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant ו rדואר להשעות את התאים ב 40 מ"ל של קר כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז פתרון. גלולה התאים פעם שנייה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 20 מ"ל של תמיסת קרים כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז. גלולת התאים בפעם אחרונה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 400 μl של פתרון קר כקרח, סטרילי, 300 מ"מ סוכרוז. הערה: צפיפות התאים בשלב זה צריכה להיות כ 1 x 10 11 מושבה יחידה להרכיב למיליליטר (CFU / ml). צ'יל את התאים על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן הם מוכנים electroporation. הוסף 1 μl של פתרון 12 פלסמיד C 0.2 מיקרוגרם / μl pCdrA :: GFP 40 μl של פ אלקטרו המוסמכת תאים aeruginosa מוכן לעיל בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל כי כבר מראש מקורר על הקרח. מערבבים את ההשעיה ולהעביר לתוך הפער אלקטרודה מראש צונן, 2 מ"מ, קובט electroporation. הערה: pCdrA :: GFP </em> C: pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, אשר נותן ההודעה הניאון של רמת תאיים של c-di-GMP ב פ זני aeruginosa, פותחו ומאומתים על ידי Rybtke et al. 12. הסר לחות בחלק החיצוני של קובט עם נייר טישו והמקום קובט לתוך תא מדגם של electroporator. דופק עם מתח של 2.5 kV, קיבול של 25 μF והתנגדות של 200 Ω. הסר את קובט ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום LB. ואז, להעביר את התאים צינור סטרילי 1.5 מ"ל microcentrifuge ו דגירה של שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. מורחים 10 μl, 50 μl ו 100 aliquots μl של התרבות לצלחות סטרילי LB-אגר בתוספת אמפיצילין (בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אשר את הביטוי GFP (excitatiעל ב 485 ננומטר, פליטה ב 520 ננומטר) על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי פיק מושבה אחת לחסן 5 מיליליטר LB. דגירה לילה כפי שמתואר בשלב 1.1. מערבבים 0.5 מ"ל של תרבות לילה עם 0.5 מ"ל 50% גליצרול בתוך 2 מ"ל בורג הצינור העליון ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. 2. הכנת תרבות Starter עבור חיסון ימים לפני המסך, צלחת פ זן aeruginosa (המכיל את pCdrA :: פלסמיד C GFP) מ -80 מעלות המניות C לצלחת LB-אגר (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי הפצת חיידקים בעדינות על הצלחת באמצעות חיסון סטרילי לוּלָאָה. דגירה את צלחת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. הערב לפני ההקרנה, לחסן מושבה אחת של פ aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מ"ל של מדיום LB (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל) בתוך tuלהיות דגירה לילה-תרבות טרום ב 37 ° C עם רועד ב 200 סל"ד. ביום של המסך, להכין תת מן מראש תרבות הלילה על ידי דילול זה הראשון עם מדיום LB טרי ל OD 600 של 1.0 ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB כדי OD 600 של 0.04 (01:25 יחס) . הערה: הנפח הכולל של המדיום המחוסן תלוי במספר הצלחות להיבדק. 5% LB נעשית על ידי דילול 100% LB עם בופר פוספט (PBS) לריכוז הנדרש. חשוב לציין, התקשורת (5% LB) מאפשרת הפעלה מכוננת של pCdrA :: C GFP ב פ aeruginosa. הוספת בר בוחש מגנטי סטרילית לתוך המיכל ומערבבים התרבות במהירות מינימלית על בוחש מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המאפשר לחיידקים להתאקלם התקשורת לפני שהם לוותר לתוך 384 גם הצלחות. 3. הרכבת חיסון דגירה של צלחות 384-היטב המכילותמולקולות קטנות הערה: עקרות וטכניקות ספטית טובות הן ערכים חשובים מאוד השלבים הבאים. כדי להכין את השליטה חיובי (100% עיכוב), להוסיף 20 סולפט tobramycin μl (25 מ"ג / מ"ל) עד ​​10 מ"ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הבקרה החיובית לתוך בארות A23 – P23 (איור 2). כדי להכין את הביקורת השלילית (0% עיכוב), להוסיף 30 sulfoxide דימתיל μl (DMSO) עד 10 מ"ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הביקורת השלילית לתוך בארות A24 – p24 (איור 2). עבור כל אחת הצלחות חותמת עם מולקולות קטנות, לחסן בהיקף של 40 μl של תרבויות לילה מדולל (המתואר בשלב 2.3) לתוך A1 בארות – P22 (איור 2). הערה: זו יכולה להיות מושגת באמצעות מטפל נוזלי לשדודot. בשל המאפיינים הטרוגנית של תרבויות חיידקים, חשוב לשמור על תסיסה מתמדת ומתונה לשמור חיידקים מופצים באופן עקבי בתקשורת תוך מחלק. כדי לעשות זאת, לשמור על ערבוב התרבות התאקלמה משלב 2.4 מגנטי במהלך מהחלק. חותם את הצלחות עם חותם חיפוי אווירי חדיר דגירה במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: החותם חדיר-האוויר הוא קריטי כדי לשמור על תנאים משתנים בכל 384 בארות וכדי לעקוף את פיתוח הפוטנציאל של הדרגתיים חמצן על פני הצלחת. מדידת 4. של צמיחה (OD 600) ו תאי ג-di-GMP רמה (GFP) כ -30 דקות לפני מדידת spectrophotometric, מראש לחמם את קורא הצלחת ל -37 ° C כדי למנוע התעבות. הוצא בעדינות את חותם כיסוי חדיר-האוויר לפני הקריאה. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטבזמן שיקוע של 0.2 שניות. לפני מדידת קרינה, לעשות רווח אוטומטי וכוונון מוקדי המבוסס על טוב A24 (שליטה שלילית) ולהגדיר את ערך יעד הרווח ב 75% (איור 2). מתוך תוכנות שליטה קוראת צלחת, לחץ על מדידת התחלה ולחץ על '' פוקוס התאמת הרווח / פלייט מזהה '' כרטיסייה. הבחירה '' התאמת מוקד '' ו '' 'ערוץ' 'בצד ימין על החלון. בחירה '' התאמת רווח '' ו '' נבחר גם '', ו סוג ב '' 75 '' כ '' ערך יעד ''. לבסוף, לאסוף גם A24 בפריסת הצלחת לפני הלחיצה על '' התחל כוונון ''. לאחר ההתאמה מתבצעת, לחץ על '' התחל מדידה ''. למדוד את הקרינה מן הכתב GFP תמורת מקסימום עירור / פליטה של ​​485/520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטב settling זמן של 0.2 שניות. איסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו. הערה: קריאות נתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנות שליטה קוראת צלחת. קריאות צפו על ידי לחיצה על סמל "מאדים" בתוך תוכנות שליטה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטית. אחזר נתונים על ידי "לחיצה כפולה" על מספר לוחית עניין לגשת לנתונים לניתוח. ניתוח 5. נתונים להעריך את אחידות השחזור של assay באמצעות הניתוח "Z החזק, המהווה את מדדי איכות הנפוצות ביותר שדווחו עבור מסכי תפוקה גבוהה. חישוב z החזק 'באמצעות הנוסחא: איפה MAD (סטיית מוחלט חציון) היא אומדן של סטיית התקן, p היא הבקרה החיובית (100% עיכוב) ו- n היא השליטה השלילית (עיכוב 0%) הוא 600 OD ו נ GFPalues. הערה: assay עם ערך z 'חסון (שחושב הן 600 OD נתונים גולמיים GFP) גדול או שווה ל -0.5 נחשבת כסוג של assay מצוין. חישוב% עיכוב הצמיחה באמצעות הנוסחה: איפה Xi OD600 הוא הערך איטרטיבית OD 600 של כל דגימה היטב. % עיכוב OD600> 0, מעכב צמיחה; עיכוב% OD600 <0, מעודד צמיחה. להעריך את עיכוב% מרמת תאיים של c-di-GMP באמצעות הנוסחא (השינוי ביחידות עוצמת קרינה שרירותית מתוקנים לשינוי צפיפות תאים): איפה Xi GFP הוא הערך GFP איטרטיבית של כל דגימה היטב. % עיכוב GFP> 0, c-di-GMP מעכב; % &# 160; עיכוב GFP <0, האמרגן ג-di-GMP. גדר סף לגילוי להיט 3 MAD מן החציון (חציון ± 3 MAD), מחושב מן המדגם גם לקריאה קטנה של כל צלחת, בהנחה של התפלגות נורמלית של נקודות נתונים. הערה: עם זאת, עיכוב ± 50% חתוך ניתן לבחור עבור מבחני מנה תגובה יותר לשחזור מדויק במידת הצורך.