Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre
Summary
Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi "vivo" di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.
Abstract
Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l'involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l'alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l'analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.
Introduction
La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1). I GVs da ovociti maturi di questi due rane sono 0,3 – 0,4 mm di diametro (figure 2, 3). Salamandre in genere hanno ovociti ancora più grandi e GVs. Ovociti completamente maturi del axolotl messicano, Ambystoma mexicanum, sono più di 2 mm di diametro e GV è di circa 0,5 mm. Così, questi nuclei sono facilmente visibili ad occhio nudo e lattinaessere manipolata in molti modi che sono impossibili con i nuclei di cellule somatiche tipiche.
Altrettanto notevole è il gigantismo dei cromosomi all'interno del GV, un fatto riconosciuto già alla fine del 19 ° secolo. Cromosomi individuali di Ambystoma e altre salamandre possono essere fino a 1 mm di lunghezza (Figure 4, 5). Quelli di Xenopus sono notevoli più piccolo, anche se con lunghezze fino a 100 pm o più, nano cromosomi tipici somatici di maggior parte degli organismi. Una caratteristica importante dei cromosomi degli ovociti è la loro straordinaria attività trascrizionale, che porta ad una delle loro più caratteristici morfologiche – centinaia di loop laterali accoppiati (Figura 5). Ogni ciclo è composto da una o poche unità di trascrizione che sintetizzano attivamente RNA. Le anse conferiscono ovocita cromosomi uno fuzzy aspetto, che ha portato il nome di cromosoma "lampbrush" dopo la loro superficialesomiglianza con le spazzole utilizzate in passato per pulire camini lampada a cherosene. 2
L'obiettivo di questo lavoro è l'uso di GVs isolati per studiare LBCs e organelli nucleari (nucleoli, corpi istone locus, e macchie). Due tecniche piuttosto diverse saranno descritte. Nel primo, la tecnica più comune, GVs sono isolati in una soluzione salina con pinze del gioielliere, brevemente risciacquato per rimuovere tuorlo aderenti, e l'involucro nucleare viene rimosso, ancora una volta con una pinza del gioielliere. I contenuti gelatinosi, contenenti i LBCs e organelli nucleari, sono autorizzati a stabilirsi su un vetrino da microscopio in vetro o coprioggetto. Tali preparati possono essere esaminati direttamente dal contrasto di fase o microscopia DIC. In alternativa, preparati possono essere centrifugati per fissare le LBCs e organelli alla diapositiva o coprioggetto. Tali preparati possono essere trattati per l'analisi molecolare dettagliata degli acidi nucleici e proteine, in primo luogo mediante immunofluorescenza e fluorescent ibridazione in situ (FISH). 3-7
Una seconda tecnica prevede l'isolamento del GV in olio minerale. 8 GVs olio isolato rimangono trascrizionalmente attivo per molte ore e sono potenzialmente utili per gli studi dove si vuole i contenuti nucleari di essere il più realistico possibile. 9,10 Poiché l'indice di rifrazione del "SAP" nucleare è vicino a quello dei LBCs e altri organelli nucleari (Figura 3), tecniche microscopiche può essere una sfida con GVs olio isolato.
Infine, a causa delle loro dimensioni e facilità di manipolazione, GVs sono materiale ideale per studi sulla membrana nucleare. Il complesso del poro nucleare è stata descritta da elettroni studi microscopici sulle buste GV anfibi 11 e osservazioni SuperResolution più recenti hanno utilizzato lo stesso materiale. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Le prime osservazioni di LBCs "vivente" GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell'introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Referências
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
