Isolatie van Giant Lampbrush chromosomen van Living Eicellen van Kikkers en Salamanders
Summary
We presenteren eenvoudige technieken voor het isoleren van giant transcriptioneel actieve lampbrush chromosomen van levende eicellen van kikkers en salamanders. We beschrijven hoe deze chromosomen "levend" te observeren door fase contrast of differentieel interferentie contrast, en hoe ze op te lossen voor fluorescentie in situ hybridisatie of immunofluorescentiekleuring.
Abstract
We beschrijven methoden voor het bestuderen van de reus transcriptioneel actieve lampbrush chromosomen (LBCs) gevonden in de eicel, of unlaid ei, kikkers en salamanders. Individuele LBCs kan tot 1 mm lang en ze verblijven in een gigantische kern, zich tot 0,5 mm in diameter. De grote omvang van de chromosomen maakt ongeëvenaarde opmerkingen van actieve genen door licht optische microscopie, maar tegelijkertijd speciale technieken vereist voor het isoleren van de kern, het verwijderen van de nucleaire envelop, en gespreid chromosomen op een microscoopglaasje. De eicel kern, ook wel de germinale vesicle (GV) wordt geïsoleerd in een medium dat gedeeltelijke gelering van de nucleaire actine maakt en behoudt de delicate structuur van de LBCs. Deze stap wordt handmatig uitgevoerd onder een dissectie microscoop behulp van een tang juwelier. Vervolgens wordt de kern envelop verwijderd, weer handmatig met een pincet juwelier. De nucleaire inhoud snel overgebracht in een medium dat Vervenrses het actine gel en laat de onbeschadigde LBCs om zich te vestigen op een microscoopglaasje. Op dit punt is de LBCs en andere nucleaire organellen kunnen worden bekeken door fase contrast of differentieel interferentie contrast microscopie, hoewel de fijnere details worden verduisterd door de Brownse beweging. Voor hoge resolutie microscopische observatie of moleculaire analyse, wordt de hele voorbereiding gecentrifugeerd om de delicate LBCs stevig hechten aan de dia. Een korte fixatie in paraformaldehyde wordt gevolgd door immunofluorescentie kleuring of in situ hybridisatie. LBCs zijn in een transcriptioneel actieve toestand en hun enorme omvang toelaat moleculaire analyse op individueel gen-niveau met behulp van confocale of super-resolutie microscopie.
Introduction
De meeste gewervelde dieren, met de opmerkelijke uitzondering van buideldieren en zoogdieren, produceren grote Yolky eieren. Ondanks de soms enorme omvang, deze eieren zijn enkele cellen die hun definitieve dimensie, terwijl nog steeds te bereiken in de eierstok van de vrouw. Ovariële eieren worden eicellen genoemd en elk bevat meestal een enkele gigantische kern, bekend sinds het begin van de 19 e eeuw als de kiemblaasje of gewoon GV. 1 Eicellen conventionele laboratorium kikker, Xenopus laevis pt Xenopus tropicalis, bereikt een maximale diameter van 1,2 mm en 0,8 mm respectievelijk (figuur 1). De GVS van rijpe oöcyten van deze twee kikkers 0,3-0,4 mm in diameter (figuren 2, 3). Salamanders hebben meestal nog groter eicellen en GVS. Volledig rijpe eicellen van de Mexicaanse axolotl, Ambystoma mexicanum, zijn meer dan 2 mm in diameter en de GV is ongeveer 0,5 mm. Aldus zijn deze kernen gemakkelijk met het blote oog en kanworden gemanipuleerd vele manieren die onmogelijk zijn bij de kernen van typische somatische cellen.
Even opmerkelijk is de gigantische omvang van de chromosomen binnen de GV, een feit reeds erkend aan het eind van de 19 e eeuw. Individuele chromosomen van Ambystoma en andere salamanders kan tot 1 mm (figuren 4, 5). Die van Xenopus aanzienlijk kleiner, maar met een lengte tot 100 urn of meer, ze dwerg typische somatische chromosomen van de meeste organismen. Een belangrijk kenmerk van eicel chromosomen hun buitengewone transcriptionele activiteit, wat leidt tot een van de meest karakteristieke morfologische kenmerken – honderden gepaarde zijdelingse lussen (Figuur 5). Elke lus bestaat uit één of enkele transcriptie-eenheden die actief RNA synthetiseren. De lussen geven eicel chromosomen een fuzzy verschijning, waardoor de naam "lampbrush" chromosoom na oppervlakkigegelijkenis met de borstels die vroeger kerosine lamp schoorstenen reinigen. 2
De focus van dit artikel is op het gebruik van geïsoleerde GVS tot LBCs en nucleaire organellen (nucleoli, histone locus lichamen, en spikkels) te bestuderen. Nogal verschillende technieken worden beschreven. In de eerste, meer gebruikelijke techniek worden geïsoleerd GVS in een zoutoplossing met behulp van een tang juwelier kort gespoeld om aanhechtende dooier te verwijderen, en de nucleaire envelop is verwijderd, opnieuw met forceps juwelen. Het gelatineuze inhoud met het LBCs en nucleaire organellen, bezinken op een glazen microscoopglaasje of dekglaasje. Dergelijke preparaten kunnen rechtstreeks door fase contrast of DIC microscopie worden onderzocht. Als alternatief kunnen de voorbereidingen worden gecentrifugeerd om de LBCs en organellen hechten aan de dia of dekglaasje. Dergelijke preparaten kunnen dan worden verwerkt voor gedetailleerde moleculaire analyse van nucleïnezuren en eiwitten, voornamelijk door immunofluorescentie en fluorescent in situ hybridisatie (FISH). 3-7
Een tweede techniek betreft het isoleren van het GV in minerale olie. 8-olie geïsoleerd GVS transcriptioneel actief blijven vele uren en mogelijk bruikbaar voor studies wanneer men wil de nucleaire inhoud zo levensecht mogelijk zijn. 9,10 Omdat de brekingsindex van de nucleaire "sap" is dicht bij die van de LBCs en andere nucleaire organellen (figuur 3), kunnen microscopische technieken een uitdaging met olie geïsoleerd GVS zijn.
Tenslotte, vanwege hun grootte en het gemak van manipulatie, GVS ideaal materiaal voor onderzoek naar de nucleaire enveloppe. De porie complex kern werd eerst beschreven door elektronenmicroscopische studies amfibie GV enveloppen 11 en recentere superresolutie waarnemingen hetzelfde materiaal gebruikt. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
De eerste waarnemingen van de "levende" LBCs uit de hand geïsoleerd GVS van kikkers en salamanders werden bijna 80 jaar geleden gemaakt door de Amerikaanse bioloog William Duryee, 19 vóór de invoering van fase contrast en DIC microscopie, voor fluorescerende immunokleuring, en voor FISH. De voordelen van LBCs voor het onderzoeken van de details van chromosoom structuur en transcriptie op individueel gen dat vereist de ontwikkeling van technieken om de LBCs hechten aan glas dia's, om ze op te …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Referências
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
