从青蛙和蝾螈的卵母细胞活巨Lampbrush染色体的分离
Summary
我们提出简单的技术从活青蛙和蝾螈卵母细胞中分离巨头转录活性lampbrush染色体。我们描述了如何通过相位对比或微分干涉对比，以及如何解决这些问题原位杂交和免疫荧光染色荧光观察这些染色体“活着”。
Abstract
我们描述研究在卵母细胞，或遗腹卵，青蛙和蝾螈的发现巨人转录活性lampbrush染色体（LBCs）方法。个别LBCs可高达1毫米的长度和它们驻留在一个巨大细胞核，本身高达0.5毫米的直径。染色体的大尺寸允许通过光学显微镜活性基因的无与伦比的观测，但在同一时间都需要分离细胞核，除去核膜，并在显微镜载玻片上扩散染色体特殊技术。卵母细胞核，也称为生发泡（GV），在培养基中，允许核肌动蛋白的部分胶凝并保留LBCs的微妙结构是分离的。此步骤是在解剖显微镜下使用珠宝商的镊子手动进行。接下来，核膜被删除，请手动再次与珠宝商的镊子。核内容被迅速转移到dispe介质RSES肌动蛋白凝胶并允许未损坏LBCs沉降到显微镜载玻片。此时LBCs和其他核细胞器可以通过相差或差分干涉相差显微镜观察时，虽然更精细细节由布朗运动模糊。对于高分辨率显微镜观察或分子分析，整个编制离心牢固安装微妙LBCs的幻灯片。然后在多聚甲醛的简要定影后跟免疫荧光染色或原位杂交。 LBCs处于转录活性状态，其巨大的尺寸允许在利用共聚焦或超高分辨率显微镜个体基因水平分子分析。
Introduction
大多数脊椎动物，与有袋类动物和胎盘哺乳动物显着的例外，产生大量yolky鸡蛋。尽管他们有时巨大的规模，这些蛋是在女性的卵巢达到其最终尺寸，同时还单细胞。卵巢卵子被称为卵母细胞，每个通常包含一个巨大的细胞核，自19 世纪初的生发泡或干脆GV闻名。在普通实验室青蛙， 非洲爪蟾和爪蟾热带的1卵母细胞，达到1.2和0.8mm分别（ 图1）的最大直径。来自这两个青蛙成熟卵母细胞的GVS是0.3 -在0.4mm直径（ 图2,3）。蝾通常有更大的卵母细胞和GVS。墨西哥螈，Ambystoma mexicanum的完全成熟的卵母细胞，是大于2毫米直径的GV是约0.5毫米。这样，这些晶核是肉眼并且可以容易地看到在许多方面是不可能的典型体细胞的细胞核被操纵。
同样引人注目的是GV，在19 世纪的最后已经承认的事实中染色体的巨大规模。 Ambystoma等山椒个体染色体可高达1毫米的长度（ 图4，图5）。这些爪的相当小的，虽然与长度可达100微米或更多，他们相形见绌大多数生物体的典型体细胞染色体。卵母细胞的染色体的一个重要特征是其非凡的转录活性，这导致其最具特征的形态学特征之一-数百成对的横向环（ 图5）。每个循环由一个或几个转录单位即积极地合成RNA。该循环给卵母细胞染色体一个模糊的外表，这导致了名为“lampbrush”染色体后，他们的肤浅相似之处在更早的时候用来清洁煤油灯烟囱刷。 2
本文的重点是采用隔离GVS来研究LBCs和核细胞器（核仁蛋白基因体和斑点）。两个而不同的技术进行说明。在第一，更常见的技术，GVS在盐溶液使用珠宝商的镊子分离，简要地漂洗，以除去附着的蛋黄，和核膜被去除，再次用珠宝商的钳子。凝胶状内容，将含有LBCs和核细胞器，被允许沉降到玻璃显微镜载玻片或盖玻片。这些制剂可直接通过相衬或DIC显微镜进行检查。或者，制剂可被离心以LBCs和细胞器附加到幻灯片或盖玻片。这些制剂随后可以用于核酸和蛋白质的详细的分子分析处理，主要是通过免疫荧光和fluorescen吨原位杂交（FISH）。 3-7
第二种技术涉及在矿物油中的GV的分离。 8油隔离GVS留许多小时转录活性并且是研究其中一个想要的核内容尽可能逼真可能有用。 9,10由于核“汁液”的折射率接近于LBCs和其他核细胞器（ 图3）的，显微技术可与油分离GVS一个挑战。
最后，由于它们的尺寸和易于操纵的，GVS是用于在核膜研究理想材料。核孔复合物首先从电子显微镜的研究描述在水陆两用车辆GV信封11和最近的超分辨率观察已使用了相同的材料。 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
从青蛙和蝾螈的手隔离GVS“生活”LBCs第一个观测到了近80年前由美国生物学家威廉Duryee，19引进相衬和DIC的显微镜前，荧光免疫前和鱼了。 LBCs的在技术的LBCs重视载玻片个体基因水平所需的开发研究染色体结构和转录的细节，来解决他们在一个栩栩如生的方式，并没有破坏他们的基本形态应用分子生物学技术的优势。几乎每一个技术，实现这些目标需要一定的适应被调查的种类和逼真的保…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Referências
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
