Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems 1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon 1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel Bewegungen beeinflussen.
Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um die Wirkung der Lockstoff und abweisende Moleküle zu bewerten. Chemo-Lockstoffen und Repellentien können mit einem Gradienten – Konzentration (z. B. Dunn Kammer oder μ-Dias) 5,6, in einer hochkonzentrierten Stelle von Mikro-p in das Wachstum / Kulturmedium verabreicht werdenipette (z. B. Drehen assay) 7 oder mit einer homogenen Konzentration von Badanwendung (z. B. Wachstumskegel collapse assay) 8,9.
Andere Verfahren umfassen ein Streifentest oder Mikrokontakt- Drucken ( & mgr ; CP), in dem eine chemo-Lockstoff oder Repellent auf der Oberfläche einer Platte als Substrat 10-12 beschichtet ist. Thestripe Test wurde ursprünglich von Bonhoeffer und Kollegen im Jahr 1987 entwickelte 13 topographische Kartierung in den Küken retino-tectal System zu analysieren. Die ursprüngliche Methode benötigt, um ein Vakuumsystem zur Beschichtung von Proteinen auf Polycarbonat Nukleopore Membranen mit gestreiften und vermaschten Matrizen. In späteren Versionen wurden die rekombinanten Proteine auf der Oberfläche einer Kulturplatte in einem Streifenmuster mit schmalen Schlitz Silizium – Matrizen 14,15 direkt gedruckt. In jüngster Zeit haben verschiedene Forschergruppen erfolgreich angewendet diesen Streifen – Assay auf die Analyse von Axon Führung Molekülaktivitäten 16-21.
<p class = "jove_content"> Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für einen Streifen Assay, der die Anziehung oder Abstoßung von Axon Führung Moleküle für die dissoziierten Neuronen im Hippocampus misst. Bemerkenswert ist, kann dieses Verfahren in der minimal ausgestatteten Labor-Einstellungen angewendet werden. Für diesen Assay abwechselnde Streifen aus einem fluoreszenzmarkierten Substrat und einem Kontrollprotein sind auf einer Kunststoffschale erzeugt eine Siliciummatrix mit 90 & mgr; m Schlitzen und beschichtet mit Laminin verwenden. In unserer Demonstration, distanzierte Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen auf abwechselnden Streifen von rekombinanten Ektodomäne von Fibronektin und Leucin-reichen Transmembranprotein-2 (FLRT2) und Kontroll – Fc – Protein 21 kultiviert. Nach 24 h der Kultur, sowohl die Axone und Zellkörper der Neuronen wurden aus den FLRT2 Streifen stark abgestoßen. Anfärbung mit einem Antikörper anti-Tau1 ergab, dass ~ 90% der Neuronen auf der Fc-beschichteten Bereiche verteilt wurden, im Vergleich zu ~ 10% auf die FLRT2-Fc, das anzeigt, daß eine starke Abstoßungs FLRT2 hatFunktion für Neuronen im Hippocampus 21.Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Streifen Assay, rekombinantes Protein und dissoziierte Neuronen aus dem Hippocampus E15.5 Maus verwendet. Dieser Assay ermöglicht die effiziente Beobachtung repulsive, attraktiv, oder neutrale Antworten von Neuronen auf ein rekombinantes Protein von Interesse in einem gestreiften Muster angeordnet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die einfache Methode für die Streifen zu erzeugen, in dem das Protein direkt auf die Oberfläche einer Kunststoffschale aufgedruckt ist, im Ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
Referências
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