Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Neutrofielen zijn de meest voorkomende en kortstondige leukocyten in omloop. Ze zijn snel aangeworven om de sites van de infectie of letsel, waar ze dienen als professionele fagocyten door de afgifte van reactieve zuurstof en stikstof tussenproducten, samen met korrels die antimicrobiële peptiden en proteasen ^1. Bij rekrutering, neutrofielen worden "geprimed" door verschillende middelen waaronder microbiële producten, chemoattractanten en inflammatoire cytokines, wat resulteert in sterk verhoogde fagocyt-functionaliteit bij aankomst op de plaats van de ontsteking ^2. De mechanismen van neutrofiel priming zijn uitgebreid bestudeerd in vitro ^3,4; echter, heeft dynamische controle van het proces in vivo niet mogelijk geweest tot nu toe.

Recent is intravitale imaging een belangrijke techniek voor het visualiseren en kwantificeren van de dynamica van cellulaire biologische processen in levende organismen worden. Intravital beeldvorming kan worden uitgevoerd via conventionele foton excitatie microscopie (bijvoorbeeld, confocale) of multifoton microscopie benaderingen ^5. Na verloop van tijd, zijn substantiële verbeteringen gerealiseerd in deze techniek waardoor verhoogde beeldresolutie, betere beeldvorming diepte, verminderde weefsel photodamage en verbeterde beeldstabilisatie ^6,7. Gezien de unieke mogelijkheid om dynamische visualisatie van cellulaire migratie en interactie in de tijd mogelijk te maken, is intravitale microscopie is uitgebreid toegepast op diverse gebieden van onderzoek in de immunologie ^8. Intravitale beeldvorming maakt immunologen beter te begrijpen en contextualiseren immuunreacties op zowel het cellulair en moleculair niveau in levende diermodellen.

Recente ontwikkelingen in de transgene als knock-in reporter muizen hebben verstrekt handige tools voor het bewaken van het dynamische gedrag van neutrofielen in levende dieren. Lysozym M promoter aangestuurde versterkt groen fluorescent proteïne knock-inmuizen werden breed gebruikt om beweeglijkheid van neutrofielen, monocyten en macrofagen karakteriseren in verschillende ontstekingsprocessen zoals extravasatie, bacteriële infecties en steriele ontstekingen ^9-15. Verder zijn transgene muizen die een cytoplasmatische fluorescentie-energieoverdracht biosensor toegepast bij het ​​bestuderen van de activiteiten van neutrofielen extracellulair gereguleerde kinase mitogen en proteïne kinase A in ontstoken darm ^16. Een muizenmodel met hoge specificiteit voor fluorescentie expressie in neutrofielen is de Catchup knock-in muizen, waarin Cre recombinase produceert en het fluorescerende eiwit tdTomato, die zelf is gekoppeld om expressie van lymfocyt antigen 6G (Ly6G) ^17. Visualisatie van Ly6G-deficiënte neutrofielen via dit model heeft aangetoond dat deze cellen uitoefenen normale functioneren met steriele of infectieuze ontstekingen in vivo context. Transgene muizen die de DsRed fluorescerende pProtein gen onder controle van de muis interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) werden gebruikt om de beweeglijke gedrag van IL-1β cellen zichtbaar – vermoedelijk neutrofielen, inflammatoire monocyten en geactiveerde macrofagen omvatten – opkomende in ontstoken huid ^18.

In vivo kan de etikettering dienen als een alternatieve aanpak voor het traceren van de cellulaire en moleculaire gedrag van neutrofielen in ontstoken weefsel. Na intraveneuze injectie van lage doses van fluorescent gemerkt anti-Gr-1 monoklonaal antilichaam (mAb), de werving cascade van Gr-1 ⁺ neutrofielen werd gevisualiseerd in de muis huidletsels die besmet zijn met Staphylococcus aureus ^19. In vivo toediening van conjugaten met streptavidine geconjugeerd 705 nm quantum dots en gebiotinyleerd anti-Ly6G mAb specifiek label circulerende neutrofielen ^20. Bovendien endocytose van dergelijke conjugaten in neutrophil vesicles maakt het volgen van snelle vesicle transport in neutrofielen migreren in het interstitium. In vivo labeling met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen tegen P-selectine glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1), L-selectine (CD62L), integrine αM (CD11b ) en chemokine (CXC motief) receptor 2 (CXCR2) in een TNFa-geïnduceerde inflammatoire model heeft de regulerende mechanismen in het spel toegelicht tijdens de vroege ontsteking ^21. Gepolariseerde neutrofielen uitsteken PSGL-1 verrijkte uropods om met CD62L aanwezig op geactiveerde bloedplaatjes, waardoor de herverdeling van CD11b en CXCR2, receptoren die neutrofielen migratie rijden en initiëren van de ontsteking.

IL-1β is een van de handtekening genen die verhoogd is geprimed ²² neutrofielen. In pIL1-DsRed reportermuizen, DsRed fluorescentiesignalen (bijv. Activering van IL-1β promoter) positief correleren met IL-1β mRNA expressie en IL-1β eiwitproductie. <sup> 18 Om het proces van neutrofiel priming controleren, werd een intravitale microscopie methode ontwikkeld waarbij inductie van huidontsteking met oxazolon (OX) in pIL1-DsRed muismodel na in vivo labeling van neutrofielen met fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb. Via dit model is het mogelijk om het gedrag en functie van geprimede neutrofielen in diermodellen van verschillende ziekten en aandoeningen te bestuderen.