Инъекция Сингенная мышиной меланомы клеток с целью определения их метастатического потенциала в Легких
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
Метастазы являются основной причиной смерти среди пациентов с злокачественными опухолями. Процесс метастатического распространения раковых клеток мало изучен, но, как представляется, включают в себя несколько этапов, включая вторжение в соседние ткани, intravasation в лимфатическую и сосудистой сети, выживание и транслокации в кровеносной системе, транссудации из сосудов на месте метастаза, адаптации к новому микросреды нового сайта и колонизации на новом месте путем пролиферации и образования вторичных опухолей. 1 Каждый из этих биологических событий включают преобразование, распространение и выживание метастатических опухолевых клеток. Например, превращение эпителиального фенотипа опухолевой клетки в мезенхимальной фенотипа, в сочетании с успешным взаимодействием с внеклеточным матриксом, чтобы они могли вторгнуться соседние ткани и метастазировать в другие части тела. 2,3 Кроме того, эти метастатический ячейкидолжны выжить в циркулирующей крови и избежать иммунного надзора от хозяина. 4,5 И, наконец, при имплантации в отдаленном месте в организме, опухолевые клетки должны адаптироваться к их микросреды, чтобы пролиферируют и образуют вторичные опухоли. 6,7 Поэтому , хотя метастаза является обычным явлением среди больных раком, метастатические опухолевые клетки имеют несколько областей уязвимости, которые поддаются терапевтическому вмешательству.
Учитывая иммуногенной характер меланомой, и недавний интерес к иммунотерапии, модели меланомы становятся все более полезными. 8 Только в Соединенных Штатах, меланома является причиной примерно 9000 смертей в год. 9 Общие места меланомы метастазирования являются кости, головной мозг , печень и легкие. Большинство метастазов в отдаленные участки происходят через кровоток. Циркулирующие опухолевые клетки в крови должны уклоняться от иммунного клиренса, достигают капиллярного слоя дистального органа ивторжению через эндотелиальные клетки кровеносных сосудов , с тем чтобы успешно утвердиться. 4-7,10, 11
Для имитации общих и вирулентных явления метастазирования, была создана мышиная клеточная линия В16-НД6. Умерший родительской линии C57BL / 6 линии клеток меланомы В16-F0, В16-НД6 является конечным продуктом 10 последовательных селекции для метастазов в легких от внутривенных инъекций (в результате B16-F10), а затем 6 последовательных селекции для проникновения мембраны мочевого пузыря. 12 Таким образом , она является надежной линии клеток меланомы для создания метастатических очагов у мышей, особенно при внутривенном введении. 13
После инъекции достаточного количества B16-BL6 клеток в хвостовую вену B57BL / 6 мыши, а затем два или более недель, чтобы позволить имплантацию и рост клеток В16 / BL6, метастатических очагов сформируют в легких. После эвтаназии и инспекции рассечением микроскопии, количествоотдельных очагов присутствует может быть определена количественно. Это, в свою очередь, может быть использован для создания эффекта доза-метастаз, так как количество клеток В16 инжектированных-BL6 коррелирует с числом очагов, сформированной на поверхности легких. Эта модель известна как "экспериментальный метастаз", где известные-метастатической клетки вводятся непосредственно в кровоток, что способствует быстрому и предсказуемое распространение и создание в легких, печени или другого органа расследования. Это в отличие от "спонтанной метастаз" , когда опухолевые клетки имплантируют, часто подкожно, и метастазах происходят из органически пролил раковые клетки. 14,15
Важно, чтобы ввести соответствующее количество клеток В16 / BL6 в хвостовую вену мышей. Слишком много, и легкие будут покрыты с метастазами и соседняя фокусы будут неотличимы друг от друга. Слишком мало, и влияние терапевтического агента будет неразличима из-за присущей различations между инъекциями. Для того, чтобы получить оптимальное число очагов на легкие из 6 мышей C57BL /, необходимо соотнести число инжектированных клеток с количеством установленного метастатических очагов на поверхности легких, принимая во внимание различимость индивидуального фокусы. Этот протокол продемонстрирует метастатической меланомой мышиной модели для мышей C57BL / 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Циркулирующие опухолевые клетки от инъекции в хвостовую вену представляют собой метастазы , которые уклоняются участки первичного роста и мигрируют через маршруты , как кровь или лимфатическую систему, иногда утвердиться в капиллярных русел отдаленных местах. 14 Протокол , описанный выше , служит моделью для вторичной метастаз. С помощью оптимального количества клеток B16-BL6 закачиваемой, экспериментаторы могут определить относительный эффект вводимого лекарства или популяции иммунных клеток, после нейтрализации, на раковых клеток метастазов.
Этот протокол имеет свои ограничения. Циркулирующие опухолевые клетки были отобраны за их способность к метастазированию и поэтому неиммуногенными, имеющие более низкие уровни главного комплекса гистосовместимости класса 1 молекул. 12 Кроме того, внезапное и кластерный введение большого количества метастазов в отличие от типичного сценария у больных где небольшое количество метастатических опухолевых клетокрассеиваются в течение длительного периода времени от локализации первичной опухоли. Кроме того, внутривенно вводимые опухолевые клетки из культуры тканей, а не из первичного происхождения опухоли. Таким образом, эти клетки в отличие от вторичных метастазов , которые возникают в результате нарушения клеточной адгезии, миграции, иммунного распознавания и реципиента создании органа. 15,16
Альтернативный протокол является подкожное введение B16 / НД6 для генерации первичных опухолей и анализ полученных «спонтанных» легочных метастазов. было обнаружено, что эти «спонтанные» метастазы содержат больше гетерогенность, чем их «экспериментальных» коллег, более тесно совпали с пациентами человека. Протокол ограничивает ее способность определить влияние экспериментального соединения на метастазирование. С боковой инъекцией в хвостовую вену, количество клеток меланомы инъецируют в кровоток может быть аппроксимирована с помощью чemocytometer. С помощью "спонтанной" метастаз, тем не менее, существует большая гетерогенность опухолей, добавляя дополнительную переменную к числу в результате фокусы легких. 16
В заключение отметим, что B16-НД6 мышиной модели меланомы в хвостовую вену представляет собой простую модель для определения влияния лечения или иммунотерапии на метастаз. При внутривенно вводят циркулирующих опухолевых клеток, исследователи могут реплицироваться, до некоторой степени, у пациентов после метастазирования. Учитывая разрушительные последствия метастатических опухолевых клеток в раковых больных, эта модель является мощным инструментом для понимания многоэтапный процесс метастазирования.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается в частично грантом Национального института рака 1R03CA172923.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referências
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
