同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

倫理文：研究におけるマウスの使用は、それが基本的な生物学のまたは疾患の最終的な治療に向けた人間の理解を進める可能性があるインスタンスでのみ許容されます。 1.注文購入雌のC57BL / 6マウス（6歳 – 8週間）、群当たり5匹のマウス。マウスのための数日間は、調整することができます。 B16-BL6細胞の調製無菌フード内で37度のインキュベーターと場所から細胞培養プレートを取り外します。プレートは、B16-BL6マウス黒色腫細胞と約70％コンフルエントであるべきです。大きなコンフルエント細胞に転移能を変化させることができます。 1分間放置し、プレートあたり1ミリリットル0.05％のトリプシン-EDTAを追加し、トリプシン培地溶液を吸引除去します。 プレート当たりトリプシンの1ミリリットルを加え、10分間インキュベーターにプレートを返します。 無菌フードにインキュベーターからプレートを移動させた後、無血清ローズウェルパーク記念研究所Mediuの4ミリリットルを追加各プレートにメートル（RPMI）。 滅菌、電動式ピペットを用いて細胞を収集します。細胞を破壊するために、非常にわずかな角度で押したチップを用いて、プレートの底から細胞を取り出します。そうでなければ排出針を詰まらせる可能性があり、細胞塊の十分な分離を確実にするために数回繰り返します。思い出すと50mlコニカルチューブに移します。 細胞密度を決定するために、血球計数器を使用してください。一定のB16-BL6細胞の総数を維持し、無血清RPMIの量を決定すること0、0.065、0.015、0.25、0.5万個の細胞/ mlの最終濃度に到達するために必要。 同様に15ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルチューブ内のメディアを分取。 5分間、2250×gでコニカルチューブを遠心。メディアをデカント。無血清RPMIの適切な量を追加し、血球計数器を経由して所望の細胞密度を確認します。追加のRPMIを追加するか、回転し、それに応じて小さくVOLUME-に再懸濁することによりdensities-調整します。 アリコート500μlの氷の上で標識された1.8ミリリットルチューブにそれぞれの細胞懸濁液。 3.尾静脈注射尾が保持しているマウスを、取り、マウスレストレーナーにリア最初にそれを導きます。制止のメインチャンバー内の胴体により、外側尾で、拘束の終わりに向かってマウスを引っ張ります。マウスが安全になるまでプッシュし続け、拘束具、プランジャーを挿入します。 外側尾静脈のいずれかが上を向いていることを90度、マウスを回転させます。アルコールパッドを使用して、積極的に尾静脈が最も表示されている場合は特に、マウスの尾の側面を清掃してください。 注：良い照明はB57BL / 6Jマウスでの効果的な尾静脈の可視化のために不可欠です。加熱ランプまたは加熱手術パッドは、必要ではないが、また、尾静脈の容積を増加させることによって助けます。 無菌培養フードで2万個の細胞/ mlのチューブからの細胞培養培地を300μlを収集します。秒をフリック、針を反転IDEとシリンジから気泡を排出するために、プランジャーを押します。 250μlの最終容量をもたらすことが文化-RPMIを取り出します。 非利き手でマウスの尾を拡張します。非利き手の人差し指と親指で押し下げ、尾の先端部に上昇尾の近位端部と尾を持ちます。 注：このように、尾静脈を横位置に保持され、尾部のより遠位部分の可能な一致するエントリと、拘束面に平行です。 そもそも分下向きの角度で、遠位端に向かって、尾静脈に針を挿入し、さらに挿入時に尾静脈の角度に合わせて、針を調整（針に注射器の相対的なプランジャー端を下げます） 。 尾静脈に針約1cmを挿入します。挿入後、着実に針を保持し、プランジャーをプッシュし始めます。 注針が尾静脈内にあり、針の端部がNである場合にotのは、メディアが静脈に妨げられることなく流れるべき遮ら。効果的な注入は、静脈からの血液クリアランスによって特徴付けられます。そこに抵抗がある、またはバブルは、注射中の部位で形成し始める場合は、針を除去し、尾静脈に沿ってより近位の場所で再試行してください。 静脈から針を外し、それを捨てます。任意の出血を止めるために進入部位に対するガーゼを保持します。 拘束からプランジャーを取り外し、受信者のケージにマウスを置きます。 他のすべての濃度について繰り返します。 注：肺病巣確立は約2取る-細胞株と焦点の所望の大きさに応じて変動して、3週間を暫定で9に 、マウスは、過度のあえぎのように、早期の安楽死を保証可能性が症状を監視する必要があります。 4.肺病巣を数えます CO 2を CO 2チャンバー内に配置し、100％に曝露することによって、マウスを安楽死させます</sUB>は5分間分あたりチャンバ容積の10から30までパーセントで導入しました。頚椎脱臼で従ってください。 発泡スチロールの上でマウスをスプレイ。手術用はさみを使用して、胸骨に沿って外科的切開を作成します。 胸骨切開の上からと胸郭を露出させ、マウスの肩に向かって分岐の両方、二つの追加の切開を行います。 肺と心臓を露出し、胴体から胸郭を削除するには、2カット、胸骨の側面に沿って各してください。 手術用ピンセットで心を持ち、マウスから心臓や肺を解放し、食道と気管をカット。より良い視覚化のために、10倍の倍率で、解剖顕微鏡の下に置きます。 肺から心臓を解剖し、胸腺を除去し、2つだけ肺を残します。 解剖範囲の下の肺では、肺の病巣をカウントし始めます。各病巣は、肺の表面上に円形、茶色の出しゃばりとして表示されます。 ためにマウスとの間の整合性は、葉の表面に病巣の数をカウントし、その葉を反転します。 4ローブの各操作を行うと、個別に簡単にカウントすることができます。 遺体を捨て、そうでない場合は、保存して、IHCを行った場合、肺を修正。