Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
Metastaz malignitesi olan hastalarda önemli bir ölüm nedenidir. kanser hücrelerinin metastaz yayılması işlemi tam olarak bilinmemektedir, ancak metastaz, adaptasyon yerinde damar komşu dokulara yayılması, intravasation lenfatiklerin ve damar sistemi, yaşam süresinde ve translokasyon dolaşım sistemi içinde, ekstravazasyonu dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir gözükeceği çoğalması ve ikincil tümörlerin oluşumu ile yeni yerinde yeni yeni sitenin mikroçevresinin ve kolonizasyon. 1 bu biyolojik olayların her metastatik tümör hücrelerinin dönüşümü, yayılmasını ve hayatta kalma içerir. Örneğin, hücre dışı matris ile başarılı bir etkileşim ile birlikte mezenkimal fenotip tümör hücresi epitel fenotipinin dönüşüm, invazyon ve vücudun diğer bölgelerinde metastaz olanak tanımaktadır. 2,3 Ayrıca, bu metastatik hücrelerbünyesinde bir uzak yerinde implante edildiğinde dolaşan kan içinde hayatta ve ev sahibi bağışıklık gözetim kaçınmak gerekir. 4,5 Nihayet, tümör hücreleri ikincil tümörler çoğalmaya ve oluşturmak için kendi mikroçevresinin uyum sağlamak zorundadır. 6,7 nedenle metastaz kanser hastaları arasında yaygın bir olgu olmasına rağmen, metastatik tümör hücrelerinin terapötik müdahale için uygun olan açığına birden alanlar var.
Melanom immünojenik doğası ve immunoterapi son faiz göz önüne alındığında, melanom için modeller. Gittikçe yararlıdır yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde 8, melanom yılda yaklaşık 9.000 ölüm nedenidir. Melanom metastazı 9 Ortak yerleri, beyin kemikler , karaciğer ve akciğer. uzak bölgelere metastaz çoğunluğu kan yoluyla ortaya çıkar. Kandaki dolaşan tümör hücrelerinin bağışıklık açıklığını kaçmasına distal organ bir kılcal yatak ulaşmalıdır vebaşarılı bir şekilde kendilerini oluşturulması için kan damarı endotel hücreleri ile işgal. 4-7,10, 11
metastaz yaygın ve öldürücü olayları taklit etmek, fare B16-BL6 hücre hattı oluşturuldu. Ebeveyn C57BL / 6 melanom hücre hattı B16-F0 bir decedent, B16-BL6 mesane membran penetrasyonu 6 arda seçimleri ve ardından (B16-F10 sonuçlanır) damar içi enjeksiyon ile ilgili akciğer metastazı 10 birbirini takip eden seçimleri, son ürünüdür. Bu nedenle 12, bu da özellikle damar içine enjekte edildiği zaman farelerde metastaz odakları kurulması için güvenilir bir melanom hücre hattıdır. 13
implantasyon ve B16 / BL6 hücrelerinin büyümesini sağlamak için iki veya daha fazla hafta ardından B57BL / 6 fare kuyruk venine B16-BL6 hücrelerinin yeterli miktarda, enjeksiyonundan sonra, metastatik odaklar akciğerlerde oluşturacaktır. Diseksiyon mikroskobu ile ötanazi ve incelenmesi üzerine, sayısıBireysel odaklar mevcut belirlenebilir. enjekte B16-BL6 hücrelerinin sayısı akciğer yüzeyi üzerinde oluşturulmuş odaklarının sayısı ile ilişkilidir gibi bu da, bir doz-metastazı etkisi oluşturmak için de kullanılabilir. Bu model bilinmektedir metastatik hücrelerin soruşturma akciğer, karaciğer veya başka bir organda hızlı ve öngörülebilir yayılmasını ve kurulmasını kolaylaştırmak, kan dolaşımına doğrudan tanıtıldı "deneysel metastaz" olarak bilinir. Bu tümör hücreleri genellikle deri altına implante edilir "spontane metastaz," aksine, ve organik kanser hücrelerini döken gelen metastaz kaynaklanmaktadır. 14,15
Farelerin kuyruk venleri içine B16 / BL6 hücrelerinin, uygun bir miktarı enjekte edilmesi önemlidir. Çok sayıda ve akciğer metastazları ile ele alınacaktır ve komşu odaklar birbirinden ayırt olacaktır. Çok az ve terapötik bir maddenin etkisi nedeniyle doğal değişkenlere ayırt edilemez olacakenjeksiyonlar arasında ations. C57BL / 6 farelerinin akciğerlerinde üzerine odaklar optimal sayısı elde etmek için, hesaba bireyin ayırt edilebilirliğini çekerken akciğer yüzeyine yerleşik metastatik odaklarının miktarı ile enjekte edilen hücrelerin sayısı ilişkilendirmek için gerekli olan odaklar. Bu protokol, C57BL / 6 fareleri için metastatik kemirgen melanoma modeli gösterecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uzak yerlere kılcal yatak kendilerini kurarak bazen, birincil büyüme siteleri kaçmasına metastaz temsil ve kan ya da lenf sistemi gibi yollarla göç bir kuyruk damar enjeksiyonu gelen dolaşan tümör hücrelerinin. 14 protokol yukarıda açıklanan ikincil bir model olarak hizmet vermektedir metastaz. Enjekte B16-BL6 hücrelerinin ideal bir sayıda, deneyci kanser hücre metastazı üzerinde uygulanan ilaç veya bağışıklık hücre nüfus, post-nötralizasyon göreceli etkisini belirlemek olabilir.
Bu protokol sınırlamaları vardır. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin özellikleri için seçilmiş ve majör histokompatibilite kompleks sınıfı 1 moleküllerinin düşük düzeylerine sahip, bu yüzden imünojenik olan edilmiştir. 12 ayrıca, metastaz sayıda ani ve kümelenmiş bir giriş hastalarda normal senaryosunda aksine nerede metastatik tümör hücrelerinin küçük numaralarprimer tümör konumundan uzun bir zaman süresi içinde dağıtır. Buna ek olarak, intravenöz olarak ortaya tümör hücreleri doku kültüründen ve bir primer tümör kökenlidir. Bu nedenle, bu hücreler, hücre yapışması, göçü, bağışıklık tanıma ve alıcı organı kurulması değişiklikler sonucu ikincil metastazlar benzemez. 15,16
Alternatif bir protokol primer tümörlerin üretimi ve elde edilen "kendiliğinden" pulmoner metastazların analizi için B16 / BL6 deri altından enjeksiyonu olabilir. Bu "kendiliğinden" metastaz kendi "deneysel" muadillerine göre daha heterojenitesini ihtiva bulunmuştur, daha yakından insan hastaların bu bulundu. protokol metastaz üzerinde deneysel bir bileşiğin etkisini belirlemek için onun yetenek kısıtlamaktadır. bir yanal kuyruk damarı enjeksiyonu ile, kan dolaşımına enjekte melanom hücrelerinin sayısı saat ile yaklaşık olarak hesaplanabiliremocytometer. "Spontane" metastaz ile, ancak, akciğer odakları ortaya çıkan sayısında ek değişken ekleyerek, tümörler arasında daha farklılıklar bulunmaktadır. 16
Sonuç olarak, kuyruk ven B16-BL6 fare melanom modeli metastaz bir tedavi veya immünoterapi etkisini belirlemek için basit bir modeli temsil etmektedir. intravenöz dolaşımdaki tümör hücrelerini enjekte ederek, araştırmacılar bir ölçüde, hastalar sonrası metastaz için, çoğaltabilirsiniz. Kanser hastalarında metastatik tümör hücrelerinin yıkıcı etkilerini göz önüne alındığında, bu model metastaz çok adımlı süreci anlamak için güçlü bir araçtır.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Kanser Enstitüsü hibe 1R03CA172923 kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referências
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
