Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Todesfälle bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Der Prozess der metastatischen Verbreitung von Krebszellen ist wenig verstanden, aber scheint mehrere Schritte beinhalten, einschließlich Invasion benachbarter Gewebe, intravasation in die Lymphgefäße und Blutgefäße, das Überleben und Translokation innerhalb des Kreislaufsystems, Extravasation aus dem Gefäßsystem am Ort der Metastasierung, Adaptation Jede dieser biologischen Ereignisse an den neuen Mikroumgebung der neuen Website und Kolonisation am neuen Standort durch die Proliferation und Bildung von sekundären Tumoren. 1 umfassen die Transformation, die Verbreitung und das Überleben von metastasierenden Tumorzellen. Zum Beispiel kann die Umwandlung des epithelialen Phänotyps der Tumorzelle in einen mesenchymalen Phänotypen, verbunden mit der erfolgreichen Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix, damit sie benachbarte Gewebe einzudringen und sich auf andere Teile des Körpers metastasieren. 2,3 Darüber hinaus können diese metastatischen Zelleninnerhalb des zirkulierenden Blutstrom und entziehen Immunüberwachung vom Host überleben muss. 4,5 Wenn schließlich an einer entfernten Stelle im Körper implantiert, müssen die Tumorzellen zu ihrer Mikroumgebung um Sekundärtumoren zu proliferieren und bilden anzupassen. 6,7 Deshalb , obwohl Metastasierung ein häufiges Phänomen bei Krebspatienten ist, haben metastasierten Tumorzellen mehrere Bereiche der Verwundbarkeit, die therapeutische Intervention zugänglich sind.
In Anbetracht der immunogene Natur des Melanoms, und die jüngste Interesse an Immuntherapien, Modelle für Melanome sind immer nützlich. 8 In den Vereinigten Staaten allein ist das Melanom die Ursache von schätzungsweise 9.000 Todesfälle pro Jahr. 9 Gemeinsame Positionen von Melanom – Metastasen sind Knochen, Gehirn , Leber und Lunge. Die Mehrheit von Metastasen zu entfernten Stellen auftreten, durch den Blutkreislauf. Zirkulierende Tumorzellen im Blut muss Immunclearance entziehen, ein kapillares Bett eines distalen Organ erreichen unddringen durch die Endothelzellen des Blutgefäßes, um sich erfolgreich zu etablieren. 4-7,10, 11
Zur Nachahmung wurde die gemeinsamen und virulent Phänomene der Metastasierung, die Maus-B16-BL6-Zelllinie erstellt. A decedent der parentalen C57BL / 6 Melanomzelllinie B16-F0, B16-BL6 ist das Endprodukt von 10 aufeinander folgenden Selektionen für Lungenmetastasen von intravenöser Injektion (resultierend in B16-F10), gefolgt von 6 aufeinanderfolgenden Auswahlen für Blasenmembranpenetration. 12 als solches ist es ein zuverlässiges Melanomzelllinie für die Einrichtung von metastatischen Foci in der Maus, insbesondere bei intravenöser Injektion. 13
Nach dem Einspritzen einer ausreichenden Menge von B16-BL6-Zellen in die Schwanzvene einer B57BL / 6-Maus, gefolgt von zwei oder mehr Wochen der Implantation und das Wachstum der B16 / BL6 Zellen zu ermöglichen, wird Metastasenherde in der Lunge bilden. Nach Euthanasie und die Überprüfung durch Sezieren Mikroskopie, die Zahl dereinzelne Brennpunkte vorhanden quantifiziert werden können. Dies wiederum kann verwendet werden, um eine Dosis-Metastase Wirkung herzustellen, da die Anzahl der injizierten B16-BL6 Zellen, die mit der Anzahl von Foci korreliert auf der Oberfläche der Lunge gebildet. Dieses Modell wird als "experimentelle Metastasierung", bekannt, bei denen bekannt-metastatischen Zellen direkt in den Blutstrom eingeführt werden, eine rasche und vorhersehbare Verbreitung und Etablierung in der Lunge, Leber oder andere Organe der Untersuchung zu erleichtern. Dies steht im Gegensatz zu "spontanen Metastasierung" , wo Tumorzellen implantiert werden, oft subkutan und Metastasen stammen aus kontrolliert biologischem Krebszellen zu vergießen. 14,15
Es ist wichtig, eine geeignete Menge an B16 / BL6-Zellen in die Schwanzvenen der Mäuse zu injizieren. Zu viele, und die Lungen werden mit Metastasen und benachbarten Brennpunkte werden voneinander nicht zu unterscheiden abgedeckt sein. Zu wenig, und der Einfluss eines therapeutischen Mittels wird aufgrund inhärenter vari ununterscheidbar seintionen zwischen den Injektionen. Um eine optimale Anzahl von Foci in den Lungen der C57BL / 6-Mäusen zu erhalten, ist es notwendig, die Anzahl der injizierten Zellen mit der Menge von etablierten metastasierenden Foci auf der Oberfläche der Lunge, während unter Berücksichtigung der Unterscheidbarkeit der einzelnen zu korrelieren Brennpunkte. Dieses Protokoll wird ein metastasierendem murine Melanommodell für C57BL / 6-Mäuse zeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zirkulierende Tumorzellen von einem Schwanzveneninjektion die Metastasen darstellen, die Websites von primären Wachstum entziehen und wandern durch Routen wie Blut oder lymphatischen Systems, gelegentlich selbst in den kapillaren Betten von entfernten Standorten zu etablieren. 14 Die oben beschriebenen Protokoll dient als Modell für die Sekundär Metastasen. Mit einer optimalen Anzahl von B16-BL6-Zellen injiziert, kann Experimentatoren bestimmen die relative Wirkung eines verabreichten Arzneimittels oder Immunzellpopulation, post-Neutralisierung, auf Metastasierung von Krebszellen.
Dieses Protokoll hat seine Grenzen. Die zirkulierenden Tumorzellen wurden für ihre Fähigkeit ausgewählt , zu metastasieren und sind daher nicht immunogen, geringere Mengen an Haupthistokompatibilitäts mit komplexen Klasse 1 – Moleküle. 12 Ferner ist die plötzliche und gruppierten Einführung einer großen Anzahl von Metastasen im Gegensatz zu dem typischen Szenario ist bei Patienten , wo eine kleine Anzahl von metastatischen Tumorzelleneinen verlängerten Zeitraum aus der primären Tumorlokalisation dissipieren über. Zusätzlich werden die intravenös eingeführten Tumorzellen aus der Gewebekultur und nicht die von einem Primärtumor Ursprungs. Daher sind diese Zellen im Gegensatz zu den sekundären Metastasen , die sich aus Veränderungen in der Zelladhäsion führen, Migration, Immunerkennung und Empfängerorgan Einrichtung. 15,16
Ein alternatives Protokoll würde für die Erzeugung von Primärtumoren und der Analyse der resultierenden "spontanen" Lungenmetastasen die subkutane Injektion von B16 / BL6 sein. Diese "spontane" Metastasen gefunden wurden, um mehr Heterogenität als ihre "experimentell" Pendants enthalten, genauer die der menschlichen Patienten entsprechen. Das Protokoll ist die Begrenzung in seiner Fähigkeit, den Einfluss einer experimentellen Verbindung auf die Metastase zu bestimmen. Mit einer seitlichen Schwanzveneninjektion, die Anzahl von Melanomen in den Blutstrom injizierten Zellen über h approximierenemocytometer. Mit "spontanen" Metastasierung jedoch gibt es eine größere Heterogenität zwischen Tumoren, Hinzufügen eine zusätzliche Variable für die Anzahl der Lungenherde entstehen. 16
Zusammenfassend stellt die Schwanzvene B16-BL6 murine Melanommodell ein einfaches Modell des Einflusses einer Behandlung oder Immuntherapie auf Metastase zu bestimmen. Durch intravenöse Injektion zirkulierende Tumorzellen können Forscher replizieren, zu einem gewissen Grad Patienten post Metastasierung. Betrachtet man die zerstörerischen Auswirkungen des metastasierten Tumorzellen in den Krebspatienten, dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die mehrstufiger Prozess der Metastasierung zu verstehen.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt durch ein National Cancer Institute Zuschuss 1R03CA172923 teilweise.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referências
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