Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Jaroslav Icha; Christopher Schmied; Jaydeep Sidhaye; Pavel Tomancak; Stephan Preibisch; Caren Norden

doi:10.3791/53966

JoVE Journal > Developmental Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologia do Desenvolvimento

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Published: April 10, 2016

doi:

10.3791/53966

Jaroslav Icha*¹, Christopher Schmied*¹, Jaydeep Sidhaye¹, Pavel Tomancak¹, Stephan Preibisch^1,2,3, Caren Norden¹

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²HHMI Janelia Research Campus, ³Berlin Institute of Medical Systems Biology of the Max Delbrück Center

Summary

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Abstract

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.

Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Introduction

Morphogenesis embriyoyu şekillendiren ve birlikte büyüme ve farklılaşma ile olgun ve çok hücreli organizma içine döllenmiş yumurtadan ontogenezini sürücüler süreçtir. Hayvan gelişimi esnasında morfogenetik işlemler sağlıklı bir canlı örneklerin ^1-3 görüntüleme iyi analiz edilebilir. Böyle bütün embriyo görüntüleme sürücü ve sinyal molekülleri degradeler, ekstraselüler matriks, damarsal, innervasyon yanı sıra çevredeki dokuya mekanik özellikleri de dahil olmak üzere gelişimini düzenleyen tüm bileşenleri korur olmasıdır. morphogenesis meydana geldiği terazi, köprü, hızlı hücre içi olaylar saatler ya da günler boyunca tüm doku gelişimi bağlamında bir dakikalık bir zaman ölçeğinde ele gerekir. Bütün bu ihtiyaçları karşılamak için dik düzlem aydınlatma mikroskobu ⁵ modern bir uygulama ⁴ geliştirildi. Başlangıçta, bu Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPI seçildiE) ^4; Şimdi bir all-kucaklayan vadeli Işık Sac Flüoresan Mikroskobu (LSFM) genellikle kullanılır. Lazer tarama veya eğirme disk konfokal mikroskoplar ^6,7 daha az fototoksisite uyaran ederken LSFM, yüksek zaman çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. Günümüzde, zaten orada temel ışık levha aydınlatma ilkesinin birçok uygulamaları vardır ve görüntü araştırmacılara ^8-11 daha önce erişilemeyen örneklerin ve süreçlerin büyük bir çeşitlilik kullanılmıştır.

Biz ilk geleneksel konfokal mikroskopi yaklaşımlar üzerinde LSFM birkaç önemli avantajlar vurgulamak istiyorum:

Canlı görüntüleme mikroskobik deneylerden anlamlı sonuçlar elde etmek için, gözlem sadece minimal örneği etkiler önemlidir. Ancak, zebrafish dahil olmak üzere birçok organizmalar fototoksisite ef olmadan yüksek zaman çözünürlüğü ile konfokal mikroskop görüntü için onları zorlu hale lazer ışığına maruz kalınmasına çok duyarlıdırdurmuş veya gecikmiş gelişme ^6,7 gibi kusurlarından. LSFM şu anda numune ⁷ üzerinde en yıkıcı etkilere sahip floresan görüntüleme tekniğidir. ince lazer ışığı levha, belirli bir zaman noktasında görüntülü numunenin sadece bir kısmını aydınlatan bu yana, ışık levha mikroskobu çok verimli fotonları kullanıyor. Sonuç olarak, düşük ışık pozlama sağlıklı örneklerin uzun zaman atlamalı gözlemler, örneğin ^12-17 sağlar. Ayrıca, LSFM minimal invaziv sayesinde, elde edilen görüntü sayısı artık değil, işlenmiş ve saklanabilir ne kadar veri numune tahammül ne kadar ışık tarafından belirlenir.

yakın fizyolojik koşullarda numune tutmanın aynı çizgide, LSFM canlı embriyoları için uygun bir alternatif örnek montaj stratejileri ile birlikte geliyor. LSFM teknikleri, embriyolar genellikle düşük yüzde agaroz ince bir sütun içinde gömülürler. mountinve aynı anda birden fazla görüşlerinden (LSFM görünümü olarak işaret edilmektedir) agaroz silindirlere g dönme özgürlüğü için sağlar, böylece örnek mükemmel bir açıdan görülmektedir. Multiview görüntüleme ve sonraki bakıslı füzyon büyük, saçılma örnekler için özellikle yararlıdır ve yüksek, izotropik çözünürlük ile yakalamak sağlar. Diğer olası LSFM montaj stratejilerinin bir özeti E. Reynaud ve laboratuvarı tarafından yazılı numune hazırlama bölümünde, resmi mikroskop kullanma kılavuzunda bulunabilir. Burada açıklanan daha gol görüntü farklı örnekler, özellikle önerilen bir okuma olduğunu.

LSFM görüntü elde etme lazer tarama konfokal mikroskop karşı, geniş bir alan kamera bazlıdır. Bu daha yüksek bir sinyal-edinilen görüntüler için gürültü oranı (SNR) ile sonuçlanır ve (on saniye başına kare yüzlerce) son derece hızlı olabilir. LSFM yüksek hassasiyet daha zayıf floresan samp görüntülenmesine olanakles yakın gelecekte endojen seviyeleri ¹⁸ veya ifade transkripsiyon faktörü gibi, endojen proteinler / Cas9 CRISPR kullanılarak etiketlendi. yüksek SNR de başarılı alt görüntü analizi için önemlidir. yüksek hız yeterince hızlı birden çok kez gelen bütün embriyo sadece hızlı hücre içi süreçleri yakalamak için gerekli olan, ama aynı zamanda görüntü edilir. gözlenen fenomen ayrı görünümlerde gelen bu birkaç z yığınlarının satın alma sırasında değişmez birden çok görüş kusursuz birleşimini sadece elde edilebilir.

LSFM avantajları genellikle görüntü kalitesi pahasına gelmiyor. LSFM yanal çözünürlüğü konfokal mikroskop çözünürlüğü biraz daha kötüdür. LSFM kullanılan algılama hedefleri alt sayısal açıklık standart konfokal kurulumları su veya silikon daldırma hedeflerinin 1.2-1.3 göre (genellikle 1.0 veya daha az) var olmasıdır. Buna ek olarak, bağlı LSFM geniş alan algılama (kadar AbsenBir iğne deliğinin ce), bir konfokal mikroskop göre daha out-of-odak ışık yoktur. -dışı odaklanan ışık miktarı, ışık tabaka kalınlığına göre belirlenir. Bununla birlikte, bu dezavantajları LSFM yüksek SNR tarafından telafi edilir. Uygulamada, bu örneğin disk konfokal edinimi ¹⁵ iplik ile karşılaştırıldığında benzer kaliteli görüntüler elde edilir. Sonuç olarak, bu hücre soyu ^15,19 izlemek için, hücre zarlarının veya çekirdekleri, örneğin gibi özelliklerin güvenilir okunmasını sağlar.

LSFM eksenel çözünürlük ışığı tabaka kalınlığı ile, bulgulama hedefi ek olarak belirlenir. Bazı durumlarda LSFM can eksenel çözünürlüklü konfokal mikroskoplar çözünürlüğünü aşacak. Işık tabaka genellikle düşük büyütme amacı ile görüntülenmiş büyük örnekler için meydana algılama hedefi, eksenel çözünürlüğü daha ince olduğunda ilk olarak, çözünürlük iyileştirme geliyor. LSFM ach nasıl ikinci yol,daha eksenel çözünürlük ieve, farklı görünümler yüksek xy çözünürlüklü bilgileri bir görüntü yığını haline kombine edildiği Multiview füzyon vardır. Elde edilen birleştirilmiş yığın yanal yönde ^20,21 çözünürlük değerlerini yaklaşan bir izotropik çözünürlüğe sahiptir. Bu makalede açıklanan birbirinin üzerine birden çok kez kayıt için strateji numunesinin ^20,21 civarında agaroz gömülü mutemet belirteç olarak floresan polistiren boncuklar kullanarak dayanmaktadır.

LSFM ticarileştirme bir sonucu olarak, bu teknik, bilim adamları ²² geniş bir topluluğa kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokolü yazma motivasyon LSFM pratik deneyim eksik gelişimsel biyologlar için bu teknoloji erişilebilir hale getirmek ve bu bilim adamlarının örnekleri ile bu teknolojiyi kullanmaya başladı elde etmektir. Bizim protokol kavramsal olarak basit mikroskop t oluşturan hafif ticari levha mikroskobu kullanırşapka kullanımı kolaydır. Biz ayrıca, belirli sorulara ^23-25 cevaplamak için uygun olabilir ev inşa LSFM kurulumları ile zebrafish görüntülenmesi için diğer son protokolleri bahsetmek istiyorum. LSFM başka giriş seçeneği daha geniş bir topluluğa ışık sac mikroskobu getirmek için açık erişim ilkeleri kullanmak açık platformlar ^26,27 vardır. donanım ve yazılım yönlerini hem dokümantasyon http://openspim.org ve https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ bulunabilir.

Bu protokol, biz LSFM ile gelişim süreçlerini incelemek için bir model sistem olarak teleost zebrafish kullanın. zebra balığı göz morfojenezini LSFM yararlarının çoğu altını bir örnektir. LSFM zaten Medaka ²⁸ ve Zebra balığı ^29,30 göz gelişimini araştırmak için geçmişte kullanılan olmuştur. Göz gelişiminin erken aşamada geleneksel mikroskopi için doğru embriyo yönlendirmek için karmaşık,hantal sarısı olarak embriyonun göz hedefini bakacak şekilde yan yatmak izin vermez. Bununla birlikte, LSFM bir agaroz kolonuna montaj, örnek yeniden üretilebilir konumlandırılabilir. Ayrıca, optik fincan sahneye optik vezikül geçiş sırasında, göz, büyük z yığını ve bakış büyük bir alanı yakalama gerektirir büyüme ile birlikte önemli morfogenetik düzenlenmeleri uğrar. Ayrıca bu sorunlar için LSFM geleneksel konfokal görüntüleme üstündür. optik fincan oluşumu süreci nedenle anlamak ve bir görünümden görüntüleme ile sadece görselleştirmek için zor, üç boyutludur. Bu izotropik çözünürlük ile çok bakıslı görüntüleme yararlı hale getirir. optik fincan oluşumundan sonra, retina lazer maruz giderek duyarlı hale gelir. Bu nedenle, LSFM ile bağlantılı düşük fototoksisite uzun süreli görüntüleme için önemli bir avantajdır.

Burada eski Zebra balığı bir embriyolar bir ila üç gün görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol mevcutgöz gelişimi odaklı nd larva. Bizim yöntem yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip 12-14 saat kadar kapsayan time-lapse video kaydı yapabilirsiniz. Bu teknik kaçınılmaz sık terabayt aralığında, büyük veri kümelerini oluşturur da önemlisi, biz de LSFM önemli bir adımdır veri işleme için bir boru hattı göstermektedir.

Protocol

NOT: Tüm hayvan çalışmaları, Avrupa Birliği (AB) direktifi 2011/63 / AB ve Alman Hayvan Refahı Yasası uyarınca gerçekleştirilmiştir. protokol örneği görüntüleme montaj gelen, kesintisiz takip edilecek anlamına gelir. pratik deneyim bağlı olarak, bir zaman atlamalı denemeyi başlatmak için 2-3 saat sürer. Veri işleme, bu sefer hesaplamasına dahil edilmez. Deney için gerekli olan tüm malzeme ilave bir belge olarak temin edilmesi başlamadan önce gerekli malzemenin kontrol listesi bulunabilir. Adım 1, 2, 3 ve 4. adımda 2, 3, 4 için ve protokol aynı zamanda resmi mikroskop işletim kılavuzuna bakın 5 sırasında toz ücretsiz eldiven giyin. Görüntüleme Deneyi önce 1. Hazırlık Çalışmaları Floresan Boncuk Stok Çözeltisi Bu protokol için, (kırmızı yayan floresan boya ile işaretlenmiş) 500 veya 1000 nm çapında polistiren boncuk kullanmayın. boncuk çalışma seyreltisi 1: 4,000. İlk olarak, 1 dakika vorteksleyin kordon stok çözeltisi. GKD 2 O. 990 ul boncuk 10 ul sulandırmak 4 ° C'de karanlıkta çözelti depolamak ve bu 1 kullanımı: 1:40 de seyreltme için stok çözeltisi olarak 100 seyreltme. Numune odası için hazırlanıyor Çözüm 100 ml'lik bir beher karışımı metilen mavisi olmayan E3 orta 38.2 mi, 10 mM N -phenylthiourea 0.8 ve 1 ml 0.4%, MS-222 içinde. Daha sonra numune odasına yüzen toz küçük tanecikler ya da çözünmemiş kristallerin önlemek için süzüldü E3 orta kullanmak faydalıdır. Floresan Balık Embriyo Seçimi deney öncesinde günlerde, floresan proteinleri ifade embriyolar hazırlayın. Sağ deneyden önce, floresan sinyal istenen gücü için floresan Stereoskop altında embriyolar sıralamak. 5-10 sağlıklı embriyolar alın ve cımbız kullanarak bunları dechorionate. NOT: Bu protokol 16-72 saat eski için optimize edilmiştirembriyolar. 2. Örnek Odası Kurma Üç Odası Windows'u Montaj (Kalınlığı 0.17 mm seçilen 18 mm çapında,) numune odasında 4 pencere, objektif için bir ve üç lamelleri ile mühürlenmiş olması vardır. % 70 etanol içinde bu lamelleri saklayın. eter ile kullanımdan önce bunları silin: etanol (1: 4). Ince forseps kullanarak pencereye lamel yerleştirin ve en küçük oluğa girdiğinden emin olun. 17 mm çaplı kauçuk O-ring ile örtün ve oda pencere aracını kullanarak aydınlatma adaptör halkası vidalayın. Diğer iki pencereler için işlemi tekrarlayın. Kalan Odası Parçaları takılması Odanın dördüncü kalan tarafına uygun bir amaç için adaptör vida. adaptörün merkezine 15 mm çap O-ring takın. cha sağ alt boşluğuna beyaz Luer-Lock adaptörü Vidamber ve sol üst açılış gri drenaj konnektörü. siyah kör tapa ile her üç kalan deliklerini kapatmayın. Peltier blok ve Allen anahtar kullanarak odasının metal kırlangıç slayt altını takın. Luer-Lock adaptörü 50 ml şırınga ile hortum takın. odasına sıcaklık probu yerleştirin. Mikroskop içine Hedefler ve Ticaret Odası takma Tüm hedefleri temiz Stereoskop altında kontrol edin. 10X / 0.2 aydınlatma hedefleri ve Plan-Apochromat 20X / 1.0 W algılama hedefi kullanın ve kırılma endeksi düzeltme yaka su 1,33 olarak ayarlanmış olduğundan emin olun. örtülü aydınlatıcı hedefleri tutarken, mikroskop içine algılama hedefi vidalayın. aydınlatıcı hedefleri kaplayan koruyucu plastik kapaklarını çıkartın. Dikkatle mikroskop içine odasına kaydırın ve sabitleme vidası ile sıkın. Sıcaklık pro bağlayınolacak ve mikroskop ile Peltier blok. NOT: Peltier blok için soğutma sıvısının sirküle iki tüp her iki konnektörleri ile uyumludur. Onlar ne olursa olsun bağlantı yönlendirme işleyen bir devre oluştururlar. odası pencereleri üst kenarına kadar adım 1.2 hazırlanan çözelti şırınga yoluyla bölme doldurun. odası sızıntı olup olmadığını kontrol edin. mikroskop, inkübasyon ve kontrol ve depolama bilgisayarları başlatın. Mikroskop çalışan yazılımını başlatın ve 28.5 ° C inkübasyon sıcaklığını ayarlamak. NOT: Tamamen dengelenmeye 1 saat sürer. Bu arada örnek hazırlayın. 3. Numune Hazırlama Agaroz Mix hazırlama Agaroz karışımı yapmadan önce 15 dakika, 70 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğu (E3 ortamı içinde çözülmüş) bir 1 ml bir örnek% 1 düşük erime noktalı agaroz eritebilir. agaroz tamamen mol sonraon, taze bir 1.5 ml tüp içine 600 ul transfer E3 orta 250 ul,% 0.4, MS-222 50 ul ve vortekse boncuk stok solüsyonu 25 ul ekleyin. NOT: Ek 75 ul embriyolar daha sonra birlikte ilave sıvı için hesaplanan iken bu, karışımı 925 ul yapar. 38-40 ° C'de ikinci bir ısıtma bloğunda tüp tutun veya agaroz içine örnek embriyolar koymadan önce kendi jelleşme noktasına çok yakın olduğundan emin olun. Embriyolar montaj (~ 1 mm iç çap, kara bir leke ile) 20 ul hacmi beş cam kılcal damarları alın ve içlerine uygun teflon ucu pistonları yerleştirin. Teflon ucu kılcal dibinde böylece kılcal yoluyla pistonu itin. girdap oluşturularak karıştırıldı, 37 ° C sıcak bir agaroz karışımı tüp içine bir cam ya da plastik bir pipet ile transfer beş embriyo (bir kez monte edilebilir bir sayı). NOT: Sıvı birlikte zekâ minimum hacim üzerinde taşımak için çalışınH embriyolar. karışımı içine kılcal yerleştirin ve piston yukarı doğru çekerek içinde bir embriyo emmek. Embriyonun baş kuyruk önce kılcal girer emin olun. piston ve örnek arasında herhangi bir hava kabarcıkları kaçının. embriyo üzerinde agaroz ± 2 cm altında ± 1 cm olmalıdır. kalan embriyoların için tekrarlayın. Agaroz tamamen sertleşene kadar birkaç dakika içinde olur ki, bekleyin ve sonra hamuru ya da bant ile bir beher duvarına onları yapışarak, E3 ortamda örnekleri saklamak. Kapiller alt açıklık örnek gaz alışverişini sağlayan solüsyonda serbest asılı olmalıdır. NOT: bölümler 3.1 ve 3.2 benzer bir protokol de OpenSPIM wiki sayfası http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation~~pobj bulunabilir. 4. Numune Konumlandırma Örnek tutucu tertibatın doğru boyutta 2 plastik kolları (siyah) takınnumune taşıyıcı gövde içine birbirlerine karşı. Onların yarık kenarları dışarıya yüzleşmek zorunda. o 2-3 mermi çevirerek gevşek kelepçe vidasını takın. sıkma vidası ile kılcal yerleştirin ve siyah renk bandı diğer tarafta görünür hale gelinceye kadar tutucu ile itin. pistonu dokunmaktan kaçının. kelepçe vidasını sıkın. kılcal dışında embriyo altında agaroz fazla 1 cm itin ve kesin. Numune tutucu disk içine kök yerleştirin. mikroskop sahne yük pozisyonunda yazılımda onaylayın. mikroskop içine dikey olarak aşağı doğru numune ile tüm tutucu kayma rehberlik rayları kullanın. Böylece manyetik tutucu disk kilitleri yerine, onu açın. Kılcal bulma Şu andan itibaren, yazılım tarafından örnek konumlandırma kontrol eder. Bulun sekmesinde kılcal seçeneğini bulun ve hemen tespit nesnenin üzerinde odak noktası haline x, y olarak kılcal ve z pozisyon seçinive lens. rehberlik için numune gezgini grafik gösterimi kullanın. bu algılama hedefi gözbebeği önünde kadar kılcal dışına hafifçe embriyo itin. NOT: 'bulun kılcal' mikroskop üst kapağı açılmalı ve örnek dışarı itti sırasında kalan protokol sadece bir adımdır. Örnek bulma 'Örnek bulun' seçeneğine geçiş ve 0.5 zoom görüş alanının merkezi haline Zebra balığı gözü getirmek. o göz ulaşmadan önce hafif levha örneğinin herhangi oldukça refraktif veya emici parçalar geçmesine olmaz ki, embriyo döndürün. Aynı şekilde, yayılan floresan numunenin dışarı açık bir yol ihtiyacı var. 'Set Ana Pozisyonu' üzerine tıklayın. mikroskobun ön kapağını açın ve buharlaşmasını önlemek için odasının üstünde 3 mm açıklığı olan plastik kapağı koydu. NOT: Sıvı seviyesi altına düşersegörüntüleme seviyesi, deney tehlikeye olacak. genel sağlık için bir proxy olarak embriyonun kalp atışı kontrol edin. Çok yavaş, başka bir numune kullanın (non-monteli kontrol grubuna göre; özgü değerler gelişim aşamasına bağlıdır). Nihai yakınlaştırma ayarı geçin ve embriyo konumunu yeniden ayarlayın. 5. Bir çok boyutlu Toplama kurma Toplama Parametreleri 'Edinim' sekmesine geçin. lazer çizgileri, algılama hedefi, lazer engelleme filtresi, ışın ayırıcı ve kameralar da dahil olmak üzere ışık yolu tanımlayın. Pivot tarama onay kutusunu etkinleştirin. bit derinliği, görüntü formatı, ışık sac kalınlığı gibi diğer edinim ayarlarını tanımlayın ve tek taraflı aydınlatma seçin. Basın 'Sürekli' ve elde edilen görüntünün yoğunluğuna bağlı olarak lazer gücü ve kamera pozlama süresini değiştirmek. NOT: ayarlamak için tüm görüntüleme ayarları kullanmak less lazer gücü (100 mW lazer, 30 msn maruz kalma süresi 0.5%), gerçek deneme için daha numuneye gereksiz fotoğraf zarar vermemek için. Işık Sac Ayarı 'Çift Taraflı Aydınlatma' ve geçiş 'Çevrimiçi Çift Yan Fusio'n kutusunu etkinleştirin. 'Lightsheet sihirbazı otomatik ayarlama' başlayın. adım adım talimatları izleyin. NOT: Sihirbaz algılama hedefi odak düzlemi içine ışık tabakası taşır ve eğimli görmemesini sağlar ve bel görüş alanının merkezinde yer almaktadır. otomatik ayarlama bitirdikten sonra, sağ ve sol ışık yaprak pozisyonları otomatik olarak yazılımda güncellenir. görüntü kalitesinde bir gelişme hemen açık olmalıdır. 'Z-yığını' onay kutusunu etkinleştirin. xz yz orto görünümünde floresan boncuk tarafından verilen nokta dağılım fonksiyonu (PSF) simetrisini inceleyerek ışık levha ayarını kontrol edin. Bu ise, herhangi birt simetrik, elle yukarı ve aşağı simetrik kum saati şeklindeki PSF (Şekil 1A) elde edilinceye kadar hafif levha parametre konumunu ayarlayın. Çok boyutlu Edinme Ayarları 'Ilk Dilim' ve 'Son Slice' seçenekleri ile z-yığını tanımlayın ve 1 mikron z adımı ayarlayın. NOT: Bu mikroskop ışık levha statik ve z, kesit ile örnek hareket ettirilmesiyle elde edilir. Her zaman z-yığınlarının hızlı edinimi için 'Sürekli Sürücü' seçeneğini kullanın. 'Zaman Serisi' onay kutusunu etkinleştirin. zaman noktalarının sayısını ve bunların arasında aralığını tanımlar. 'Multiview' onay kutusunu etkinleştirin. x, y, z ve açı bilgilerin depolandığı Multiview listesine, içine geçerli görünümü ekleyin. diğer istenen görüşlerini kılcal döndürmek ve tanımlamak için sahne denetleyicisi kullanın. Her görünümü z-yığını kurmak ve Multiview listesine ekleyebilirsiniz. NOT:Görüntü elde edilir iken kılcal, tek yönlü açık olduğunu, böylece yazılım, bir seri şekilde görüşlerini sıralar. Drift Düzeltme ve Deneme Başlangıç kurmak edinme tamamlandığında, gerçek deney başlamadan önce 15-30 dakika bekleyin. NOT: Numune başlangıçta x, y ve z birkaç mikrometre sürükleniyor, ama 30 dakika içinde durması gerekir. Numune daha uzun süre sürüklenen devam ederse, başka bir numune veya yeniden monte kullanın. Veri kaydedilmesi gereken nasıl tanımlamak 'streaming' seçeneğini koruyun 'sekmesine ve geçiş gibi, her bir görünüm ve kanal için bir zaman noktasında veya ayrı bir dosya için bir dosya. Geri 'Acquisition' sekmesine gidin basın "Deneme başlatın 've dosya adını, bu kaydedilmesi gereken konumu ve dosya biçimini (kullanım .czi) tanımlar. Her şey kusursuz çalıştığını doğrulamak için ilk kez noktasının satın gözlemleyin. Hemen kayıt işlemine devamve ilk kez noktasının füzyon o bütün veri kümesini işlemek mümkün olacaktır onaylamak için, adım 6 ve 7'de açıklandığı gibi. 6. Multiview Kayıt Multiview İmar Uygulaması görüntüleme oturumun sonunda, bir veri işleme bilgisayara mikroskop veri depolama bilgisayarlar arasında veri aktarımı. 'MULTIVIEW kullanın ReconstructionApplication '20,21,31 veri işleme Fiji 32 (Şekil 1B) sağlanmış olur. DataSet tanımla > Güncelleme Fiji> Fiji> Yardım Güncelleme ImageJ ve Fiji> Yardım: Fiji güncelleyin. Ana ImageJ ve Fiji güncelleme siteleri kullanın. Bir klasör içine tüm veri kümesi aktarın. Sonuçlar ve işleme ara dosyaları bu klasöre kaydedilecektir. MultiView İmar Uygulama başlatın: Fiji> Eklentiler> Multiview İmar> Multiview İmar Uygulaması. 'Yeni bir veri kümesi tanımlamak' seçin. veri kümesi türü olarak meu seçeneği "Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats)" seçin ve .xml dosyası için bir ad oluşturun. Sonra veri kümesi (endeks olmadan yani dosyası) ilk .czi dosyasını seçin. Bu görüntü verilerin yanı sıra kayıt meta verileri içerir. NOT: Program ilk .czi dosyayı bir kere açıldıktan sonra, meta programa yüklenir. açılar, kanalları, aydınlatmaları sayısı onaylamak ve meta gelen voksel boyutu gözlemleyin. Fiji hata mesajları gösteren, işleme ve sonuçları, 'ViewSetup Explorer' ve bir konsol ilerleme gösteren, bir günlük penceresi: OK tuşuna basarak üzerine açık üç ayrı pencere (Şekil 1C) gözlemleyin. NOT: 'ViewSetup Explorer' her görünüm, kanal ve aydınlatma gösterir ve seçimine izin veren bir kullanıcı dostu arayüzü ilgi dosyaları. Buna ek olarak, 'ViewSetup Explorer' tüm işlem adımları direksiyon sağlar. işlenmesi gereken ve kaşif farenin sağ tuşuna dosyaları seçin. Farklı işlem adımları (Şekil 1C) açık bir pencere gözlemleyin. veri kümesini tanımlayan üzerine, verilerle klasördeki bir .xml dosyası oluşturulur görüyoruz. NOT: Bu dosya, önce teyit edildi meta verileri içerir. Sağ üst köşede iki düğmeleri 'bilgi' gözlemlemek ve 'Kaydet'. 'Bilgi' tuşuna basarak .xml dosyasının içeriğinin bir özetini görüntüler. Basmak işleme sonuçlarını kaydetmek 'Kaydet'. NOT: Farklı işleme aşamaları ihtiyaç 'MultiView İmar Uygulaması' işleme Fiji kapatmadan önce .xml içine kaydedilecek iken. OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/> Şekil 1: Multiview İmar iş akışı ve faiz nokta tespiti (A) floresan boncuk görüntüleme dayalı Işık levha hizalama.. boncuk görüntü xz ve yz projeksiyonlar simetrik kum saati şeklindedir sistem, (ortada) hizalanmış. her iki yönde hizalanmış ışık tabakanın örnekleri sol ve sağ gösterilmektedir. xz içinde 500 nm boncuk maksimum yoğunluğu projeksiyonları, yz ve xy eksenleri gösterilmiştir. lightsheet doğru hizalanmış duruma göre hizalanmış, yan lob (xy) havadar, diskin merkezi tepe yoğunluğuna oranı, daha fazla olduğuna dikkat edin. Görüntüler 0.7 zoom 20X / 1.0 W amacı ile alınmıştır. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. (B) veri seti tanımlanır ve daha sonra HDF5 biçime resaved edilir. boncuklar segmente ve sonra kayıtlıdır. Bir zaman serisi için her zaman noktası referans zaman noktasında üzerine kayıtlı. veri nihayet içine kaynaşmışTek izotropik hacim. (C, üst) ViewSetup Explorer zaman noktaları, açılar, kanalları ve veri kümesinin aydınlatma kenarları farklı gösterir. BigDataViewer penceresi ViewSetup Explorer'da seçilir görünümünü göstermektedir (C alt sol köşesinde). (C, orta sağ) Sağ ViewSetup Explorer'a tıklayın işleme seçeneklerini açar. (C, sağ alt köşe) ilerleme ve işleme sonuçları günlük dosyasında görüntülenir. (D ve E) algılama amacı burada interaktif boncuk segmentasyon ekran olarak gösterilen mümkün olduğunca numunedeki az algılama ile segmentinde birçok ilgi noktaları (boncuk) etmektir. (D ve E, sol üst köşe) segmentasyon iki parametre, Sigma 1 ve Eşik için Fark-of-Gauss Değerleri ile tanımlanır. (D) doğru bir şekilde tespit boncuk büyütülmüş görünümü ile başarılı bir algılama örneği. Çok yanlış pozitif ve tek bir boncuk birden algılamaları ile (E) Segmentasyon. (C) Ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. HDF5 Formatında DataSet yeniden kaydedin Tüm veri kümesini kaydetmeniz, Ctrl / Elma + a ve sağ tıklama ile tüm dosyaları seçin. Ardından Resave veri kümesini seçin ve hdf5 olarak. Bir pencere mevcut veri setinin tüm görüşleri resaved bir uyarı görüntülemeden görünecektir. Basın evet. NOT: Program her dosyayı açıp hdf5 biçimi farklı çözünürlük seviyelerini kaydetmeyi tarafından hdf5 için .czi dosyalarını yeniden devam edecektir. tamamlanmasından sonra 'done' ile o teyit edecektir. usuall kaydetmeyiy timepoint başına birkaç dakika sürer (bakınız Tablo 1). NOT: hdf5 biçimindeki dosyalar çok hızlı yüklenebilir bu yana, '(açık / kapalı) BigDataViewer ekranda' kaşif 'içine sağ tıklayarak "ve geçiş yaparak kayıt dışı veri kümesini görüntülemek için artık mümkün. Bir BigDataViewer penceresi seçilen görünümde (Şekil 1C) ile görünecektir. BigDataViewer 33 temel işlevleri Tablo 2 ve http://fiji.sc/BigDataViewer açıklanmıştır. Faiz Puan Algılama Faiz noktaları tespit seçmek için, Ctrl / Elma + a ile tüm zamanların noktalarını seçmek ve sağ tıklayın. Select Fark-of-Gauss 34 faiz noktası tespiti türü için. boncuk tabanlı kayıt etiketi faiz noktaları için alana burada yazın "boncuk" kullanıldığı için. 'Segmentasyon öncesinde görüntüleri Altörnekle' etkinleştirin. Bir sonraki pencerede, det gözlemlemekection ayarları. 'Altpiksel yerelleştirme' kullanım '3 boyutlu karesel bir uyum' 34 ve boncuk segmentasyon kullanımı 'i'nterest noktası şartnamede' interaktif 'için Fark-of-Gauss değerleri ve yarıçapı belirlemek için. 'Altörnekleyebilirsiniz XY' kullanımı 'Maç Z Çözünürlük (daha az altörnekleme)' ve 'altörnekleyebilirsiniz Z' kullanım 1 × için. z adım boyutu böylece sadece aşağı z çözünürlüğü yeterlidir maç için xy örnekleme, xy piksel boyutundan daha büyüktür. 'CPU (JAVA) üzerine bilgi işlem' seçeneğini seçin. Basın 'Tamam'. Bir pop-up pencerede, açılan menüden parametreleri test etmek için bir görünümü seçin. görünüm yüklendikten sonra, parlaklık ve Fiji ile pencerenin kontrast> Görüntü ayarlamak> Ayarla> Parlaklık / Kontrast veya boncuk tespiti için Ctrl + C onay kutusunu Shift 'maksimum (yeşil) bakmak için'. Mağrası 'viewSetup' yeşil halkalarda segmentasyon gözlemlemekd tespitler minimumluk maksimum ve kırmızı ararken. Segmentasyon iki parametre, Sigma 1 Fark-of-Gauss Değerleri ve Eşik (Şekil 1D) tarafından tanımlanır. Segment numune etrafında birçok boncuk ve olası (Şekil 1D) olarak numune içinde olduğunca az yanlış pozitif algılamaları onları ayarlayın. Sadece bir kez ve birden çok kez (Şekil 1E) her boncuk, algılar. Optimal parametreleri belirlendikten sonra, basın 'done'. NOT: Algılama zaman noktasında her görünümü yükleme ve boncuk segmentlere başlar. günlük dosyasında, program görüntüleme başına tespit edilen boncuk sayısını verir. Algılama birkaç saniye içinde yapılmalıdır (Tablo 1 e bakınız). Algılamaların miktarı uygun olduğunda basın (görünüm başına birkaç bin 600) kaydedin. NOT: Bir klasör veri dizininde oluşturulur, BİLİŞİM içerecektir hangitespit edilen boncuk koordinatlar konusunda n. Faiz Puan kullanma Kayıt Ol Ctrl / Apple ile her zaman noktalarını seçmek sağ tıklayın ve 'Faiz Points kullanarak Kayıt' seçin, +. 'Kayıt algoritması "olarak boncuk tespiti için' hızlı 3d geometrik karma (rotasyon değişmeyen) 'kullanın. NOT: Bu algoritma birbirlerine göre farklı görüşlerin yönelim ve konumlandırma konusunda hiçbir ön bilgi varsayar. birbirlerinin üzerine görüşlerin kayıt için 'Kayıt türü' olarak 'bireysel timepoints kayıt' seçeneğini seçin. Seçilen kanalda 'faiz noktaları', faiz noktaları için önceden belirtilen etiket şimdi (yani "boncuk") görünür olmalıdır. Bir sonraki pencerede, kayıt için önceden ayarlanmış değerleri kullanın. 'Fix fayans: İlk karo ve geri harita etmeyin kullanımını Fix' seçerek ilk görünümü düzeltmek til if (bu kullanmakes 'fayans geri Harita' bölümünde) sabit değildir. 'Regularization' ile 'afin dönüşüm modeli' kullanın. NOT: RANSAC için izin verilen hata 5px olacak ve 'bir tanımlayıcı maç için önemi' regularization 'dönüşüm% 10 katı ve 90 olduğu anlamına gelir 0.10 lambda, bir' sert modeli 'kullanın 10. olacaktır % ilgin 35. OK tuşuna basın kayıt başlatmak için. NOT: Günlük penceresinde görüntülenen gibi, ilk her görünüm, diğer tüm manzarasına sahip eşleşti. Sonra rastgele örnekleme konsensüs (RANSAC) 36 yazışmaları testleri ve yanlış pozitif dışlar. sağlam Kayıt için RANSAC değeri% 90 daha yüksek olmalıdır. iki görüş arasındaki karşılık gelen gerçek adayların yeterli sayıda bulunduğunda, bir dönüşüm modeli piksel ortalama deplasmanlı her maç arasına hesaplanır. Sonra iteratif global optimizasyon yürütülen ve tüm görünümler edilir Sabit görünümü üzerine kayıtlıdır. Başarılı kayıt ile, bir dönüşüm modeli hesaplanır ve ölçekleme ve piksel deplasman görüntülenir. Ortalama hata optimal altında 1 px ve tescil saniye (Tablo 1) yürütüldüğünde 1'e yakın dönüşümün ölçeklendirme olmalıdır. Numune içinde ince yapılar üzerinde gözlemlendiği gibi farklı görünümler arasında hiçbir kayma, örneğin hücre zarları olduğunu onaylayın. Sonra .xml dosyasına her görünüm için dönüşüm kaydedebilirsiniz. NOT: Şimdi kayıtlı views BigDataViewer (Şekil 2A) 'de birbiriyle çakışan ve boncuk görüntüleri de bindirilirken olmalıdır (Şekil 2B). > Son / En Yeni Dönüşüm Dönüşümleri Kaldır seçeneğini seçin zaman noktaları sağ üzerlerine tıklayınız seçerek dönüşümleri çıkarın ve. 2 re "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/> Şekil 2:. Multiview yeniden Sonuçları (A) aralarında örtüşme göstermek için farklı renkte kayıtlı görüşlerini, her Overlaid. (B) farklı görüşlerden görüntülü boncuk PSFs çakışmasını gösteren görünümü Büyütülmüş. (C) Yakın füzyon sonra boncuk kadar, PSF farklı görüşlerin bir ortalamasıdır. Arakesit ters evrişim PSF tek bir noktaya çöker olduğunu gösterdikten sonra (C) 'deki ile aynı kordonun (D) PSF. (E) xy bölümü ve membranlar derin doku z sinyalin GFP gösteren bozulma ile etiketlenmiş olan bir optik vezikül, bir tek bir görünüm (F) YZ bölümü. (G) xy bölümü ve biraz daha fazla Degra yaklaşık 20 derece dışında 4 görüşlerin ağırlıklı ortalama füzyon sonra aynı bakış (H) yz bölümGenel ded xy çözünürlüğü ancak artan z çözünürlük. (I) 'in XY kesit ve çözünürlük ve xy ve Z her ikisi de sinyalinin tersine önemli bir artış gösteren arakesit dekonvolüsyon sonra aynı verilerin (J) YZ bölümü. (EJ) görüntüleri tek bir optik dilimleri vardır. Ölçek çubuğu temsil 50 mikron (A, B, EJ) ve 10 um (C, D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Time-lapse Kayıt sağ tıklayın ve zamanla time-lapse stabilize etmek için 'Faiz Noktaları kullanarak Kayıt Ol', bütün zaman hızlandırılmış seçin. Içinde 'Temel Kayıt Parametreleri penceresinde kayıt türü için bir referans zaman noktası karşı Maç (hiçbir global optimizasyon) seçin.' Ke ep t o diğer ayarlar bireysel zaman noktalarında kayıt aynı. GelecekPencere, bir zaman noktasını seçmek referans, geçen zaman içinde orta tipik bir zaman noktası olarak kullanılır. Her zaman noktasında tek tek görüşlerini zaten birbirinin üzerine kayıtlı beri kutuyu işaretleyin, 'katı bir birim olarak her zaman noktası düşünün'. 'Show timeseries istatistik' kutusunu işaretleyin. diğer kayıt parametreleri düzene dahil eskisi gibi kalır. OK tuşuna basın. NOT: Günlük penceresinde, aynı çıkış bireysel zaman noktası kayıt olarak görüntülenir. Bireysel zaman noktalarında kayıt başarılı ve sağlam olsaydı, RANSAC şimdi 99-100 ve% ortalama, minimum ve maksimum hata genellikle 1 px altındadır. Devam etmeden önce bu kayıt kaydedin. 7. Multiview Fusion NOT: Kayıt adımlar kaynaklanan dönüşümleri birden çok kez dışarı kaynaşmış izotropik yığını hesaplamak için kullanılır. Bu yığın haz aralığı şimdi xy orijinal piksel boyutuna eşittir, çünkü orijinal verilerle karşılaştırıldığında z dilim sayısı arttı s. Füzyon içerik tabanlı Multiview füzyon 21,31 veya her ikisi Multiview yeniden uygulamasında uygulanan Bayes tabanlı Multiview deconvolution 31, ya yapılabilir. Sınırlayıcı kutu NOT: Füzyon böylece sınırlayıcı kutu ölçüde işleme hızını artırır tanımlayarak veri miktarını azaltarak, bir hesaplama pahalı bir süreç (Tablo 1) 'dir. her zaman noktaları sağ tıklayın ve 'Sınırlayıcı Kutuyu' tanımla seçin seçin. 'BigDataViewer ile tanımla' kullanın ve sınırlayıcı kutunun için bir ad seçin. 'Min' ve her 'max' için kaydırıcıyı hareket ettirin ilgi bölgeyi belirlemek için eksen ve ardından 'Tamam' düğmesine basın. sınırlayıcı kutunun parametreleri görüntülenir. NOT: Sınırlayıcı kutu içinde her şeyi içerecekşeffaf kırmızı bir tabaka ile kaplanmış olan yeşil kutu. İçerik tabanlı Multiview Fusion NOT: İçerik tabanlı Multiview füzyon 21 yerine basit ortalamasını kullanarak daha iyi görüntü kalitesi için yüksek ağırlıkları dikkate yığının üzerinde görüntü kalitesi farklılıklarını (z sinyalin yani bozulması) alır ve uygular. 'ViewSetup Explorer' erimiş olmalıdır zaman noktasını (lar) ı seçin, sağ tıklayın ve 'Görüntü Fusion / Dekonvolüsyon' seçiniz. Görüntü Fusion penceresinde, açılan menüden 'Ağırlıklı ortalama füzyon' seçin ve tercih 'Sınırlama Kutusunu için önceden tanımlanmış Sınırlayıcı Kutuyu kullan'. select kaynaşmış görüntünün çıkışı için zaten hdf5 mevcut dosyaların yeni hdf5 dosyaları yazar ve birlikte kayıtlı kaynaşmamış görüş ve erimiş görüntü kullanılarak izin verir, 'geçerli XML Projesi ekleme'. Basın 'Tamam'. Ardından 'Sınırlayıcı Kutuyu & # Ön tanımlamak39; daha önce tanımlanmış sınırlama kutusunun adını seçin penceresi açılır ve 'OK' tuşuna basın. Bir sonraki pencerede sınırlayıcı kutusunun parametrelerini gözlemleyin. Hızlı füzyon için, erimiş veri kümesi üzerinde bir aşağı örnekleme geçerlidir. NOT: erimiş yığın belirli bir boyutun üzerinde ise, program daha fazla bellek etkin 'ImageLib2 containe'r kullanarak önerecektir. Daha büyük verilerin işlenmesine izin 'PlanarImg (büyük resimler, görüntülemek için kolay) ya da CellImg (büyük resim)' konteyner için 'ArrayImg' geçin. Aksi takdirde önceden tanımlanmış ayarları kullanmak ve 'harmanlama ve içerik tabanlı füzyon' uygulayın. 'OK' tuşuna basarak devam edin. Bir sonraki pencerede hdf5 ayarlarını gözlemleyin. Önceden tanımlanmış parametreleri kullanın ve füzyon işlemini başlatın. Fiji yeterli bellek tahsis emin olun Düzenle> Seçenekler> Bellek ve konu. Multiview Dekonvolüsyon NOT: Multiview Dekonvolüsyon 31 anot olduğubakıslı füzyon onun tipi. Burada ek olarak füzyon için, görüntüleme sisteminin PSF sinyalinin görüntüsü ve verimi yüksek çözünürlük ve kontrast deconvolve amacıyla dikkate alınır (Şekil 2C-J, Şekil 5 ve Film 3 karşılaştırıldığında). Zaman noktasını (ler) deconvolved edilecek seçin, sağ tıklayın ve basın 'Görüntü Fusion / Dekonvolüsyon'. 'Multiview Dekonvolüsyon' ve kullanım 'önceden tanımlanmış sınırlayıcı kutusu ve geçerli XML projeye eklenecek' seçeneğini seçin. Sınırlama kutusunu seçin ve devam edin. NOT: Dekonvolüsyonun için önceden tanımlanmış parametreler iyi bir başlangıç noktasıdır. İlk deneme kullanımı '20 yineleme için hata ayıklama modu '' ve kullanarak Dekonvolüsyonun etkisini değerlendirmek '. Nihayet için 512 x 512 x 512 bloklar üzerinde bilgi işlem ayarlayın. Bir sonraki pencerede, önceden tanımlanmış ayarları kullanmak. her '5 ite sonuçlarını görüntülemek için' hata ayıklama modu 'Seterzak '. NOT: Dekonvolüsyonun çıktı ancak BigDataViewer şu anda sadece 16-bit veri destekler, 32-bit veri olduğunu. Mevcut hdf5 veri kümesi dekonvolüsyon çıkışını eklemek için, bu 16-bit dönüştürülmesi gerekir. dönüşüm için, koşmak '(zamanla şiddetleri doyurabilecek olabilir) ilk görüntünün min / max kullan'. NOT: Dekonvolüsyonun sonra görüntüleri yükleme ve Dekonvolüsyonun için onları hazırlamak başlayacak. BigDataServer Çok büyük XML paylaşmak amacıyla / HDF5 veri setleri http sunucusu BigDataServer 33 kullanın. Böyle sunucuya bağlanmak nasıl kurulum ve bir giriş http://fiji.sc/BigDataServer bulunabilir. Varolan BigDataServer açık Fiji> Eklentiler> BigDataViewer> BrowseBigDataServer bağlanmak için. penceresine bağlantı noktası da dahil olmak üzere URL'yi girin. NOT: Bu yayında açıklanan filmler bu reklama üzerinden erişilebilirelbise: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085 Mevcut film seçerken sağlayan bir pencere gözlemleyin. Çift BigDataViewer penceresini açın ve daha önce açıklandığı gibi verileri görüntülemek için tıklayın. Ek: başlamadan önce gerekli Malzeme Listesi Zebra balığı embriyolar / floresan proteinleri ifade larvaları (metilen mavisi olmadan Zebra balığı E3 ortamda embriyolar tutun. aşamaları için 24 saat daha eski 0.2 mM nihai konsantrasyona PTU ekleyerek pigmentasyon karşı.) floresan stereoskop (Kara bir leke ile 20 ul hacim) kılcal damar ve uygun pistonları (kılcal tekrar etmeyin. Pistonları, diğer taraftan, çeşitli deneyler için yeniden kullanılabilir.) 1.5 ml'lik plastik borular keskin cımbız Cam (yangın cilalı) ya da plastik pipetler (plastik 24 saat ve üzeri embriyolar için kullanılabilir) cam veya plastik tabaklar çapı 60 mm (plastik olabilir24 saat ve üzeri embriyolar için kullanılır) iki kez 100 ml'lik beher infüzyon için 150 cm uzatma hortumu 50 ml Luer-Lock şırınga (hortum ve şırınga mikroorganizmalar tarafından kirlenmesini önlemek amacıyla deneyler arasında tamamen kuru tutulmalıdır.) plastisin düşük erime noktası (LMP) agaroz E3 ortamı (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 4 mM 0.33 MgSO ^) MS 222 (Tricaine) feniltiyoüre (PTU) (Burada boncuk olarak anılacaktır) flüoresan mikro çift distile H 2 O (GKD 2 O)

Representative Results

LSFM ölçekler arasında gelişimsel süreçleri görüntülenmesi için ideal bir yöntemdir. Çeşitli uygulamalar, hücre içi yapılarda, hem de hücre ve tüm dokuların hem kısa hem de uzun dönem görüntü elde etmeyi gösteren Burada derlenmektedir. Bu örnekler aynı zamanda LSFM retina nöron optik fincan oluşumu göz gelişiminin çeşitli aşamalarında yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Film 1 ilk sağlam bir embriyonun bir uzaklaştırdınız görünümünü gösteren, genel LSFM yaklaşımının bir örneği olarak hizmet vermektedir aydınlık agaroz silindir gömme ve daha sonra floresan kanal retinanın ayrıntılı bir görünüm gösteren. Film 1:. Zebra balığı retina LSFM LSFM yaklaşım göstermek için, bu film embriyo a içinde bozulmadan görüntülü aydınlık ilk gösteriyorfloresan geçmeden önce silindiri garose. Daha sonra görüş büyük bir alan bütün retinanın gözlem sağlayan gösterilmiştir. Sonraki film iyi hücre içi çözünürlük vurgulamak için retinanın büyütülmüş küçük bölgesini gösterir. Bir Ath5 GAP-GFP 37 transgenik zebrabalıkları embriyo görüntüleme için kullanılmıştır. Bu transgen retina (özellikle ganglion hücrelerinin ve fotoreseptör öncüleri) farklı nöronlar etiketler. Filmin floresan kısmı 5 dk aralıklarla 40X / 1.0 W objektif kullanarak çift taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak ele geçirildi. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Film 2 çok hızlı hücre içi olaylar yüksek çözünürlüklü yakalanabilir nasıl gösteriyor; Mikrotübüllerin büyümesi bu durumdaonların artı retina nöronal progenitör hücrelerin biter. Filmde yer alan bilgiler mikrotübül artı uç büyüme takibi ve ölçümü için izin verir. Film 2:. Tek bir hücrede Mikrotubul dinamikler Bu film artı uç işaretleyici protein EB3-GFP 38 etiketli mikrotübül artı ipuçları büyüyen yakalar. proteinin tek retina projenitör hücrede ifade edilir. mikrotübül bazal apikal yönden ağırlıklı olarak büyüyen (yukarıdan aşağıya). EB3 kuyruklu ortalama hızı 0.28 ± 0.05 mm / sn olarak ölçüldü. yüksek mikrotübül çekirdeklenme etkinliği arzeden hücrenin apikal tarafında parlak nokta sentrozom olduğunu. vahşi tip embriyo hsp70 enjekte edildi: EB3-GFP plazmid DNA. Film, yaklaşık 28 hrpost fertiliz ısı şoku (37 ° C'de 15 dakika) sonra, 4 saat satın alındıtirme 63X / 1.0 W objektif ve 1 sn zaman aralıkları kullanılarak tek taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak (hpf). Tek hücre retinanın çoğunluğu kapsayan bir görüş alanından kırpılmış. İki dilim projeksiyon gösterilmiştir maksimum yoğunluğu. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Şekil 3, ne hücre içi yapıların uzun saatler boyunca takip edilebilir. Burada, retina ganglion hücrelerinin (RGCs) translocating içinde sentrozom yakalanır. Şekil 3:. Retina ganglion hücre translokasyonu sırasında Sentrozom yerelleştirme time-lapse deney Bu montaj retina ganglion hücre (RGC) olgunlaşma boyunca sentrozom konumunu gösterir.nöronal atalarıdır içinde sentrozom apikal süreci (1:00) en ucunda lokalize olur. hücre bölünmesi sırasında, iki sentrozomlar mitotik (2:25) için kutuplar olarak hizmet vermektedir. Bu bölünme, bir RGC ve fotoreseptör hücre öncülü olan bir ikinci kızı hücre içine ayıran bir kızı hücrede sonuçlanır. apikal süreç apikal tarafında bağlı kaldığı sürece ikiye ayrılmasından sonra, RGC hücre gövdesi, retinanın bazal tarafına translocates. RGC bazal tarafı ulaştığında, onun apikal süreç ayırır ve sentrozom o (06:15) ile hareket eder. kademeli apikal işlem (06:50, 07:20, 08:10) ile birlikte geri çekme sırasında sentrozom takip edilebilir. sentrozom hala apikal lokalize iken son karede yer (08:55) ganglion hücre, kendi bazal taraftan bir akson büyüyor. mozaik ifadesi, bir hücre aşamasında vahşi tip embriyo plazmid DNA enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Hücreler Ath5 tarafından görüntülenmiştir: GFP CAAX (yeşil) constRGCs ve diğer nöronlar etiketler dürme. Sentrozomlar (ok başları) fotoseli-tdTomato 29 ifadesi (kırmızı) ile etiketli. retinanın apikal yan altındaki görüntünün üst ve bazal tarafında yer almaktadır. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 saat sonra döllenme (hpf) başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4'te görüntülendiğinde, bu tür Movie 1 deki gibi tüm doku yakalama veri elde edilebilir nasıl tek bir hücre davranışı. Bir RGC Translokasyon kolaylıkla takip ve apikal ve bazal süreç olabilires izledi. Şekil 4:., Şekil 3'te açıklandığı gibi, tek bir retinal ganglion hücre Translokasyon retina taban tarafına apikal arasında RGC translokasyon terminali mitoz sonra ortaya RGC Ath5 sentezlenmesiyle etiketlenmiştir. Boşluk GFP 37 transgen. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 hpf başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5 doku sc yakalamak için Multiview LSFM yeteneğini gösteriroptik vezikül bir optik fincan dönüşür sırasında optik fincan morfolojilerinden örnek hücresel çözünürlük ile bira morfogenetik süreçler. Görüntü kalitesi büyük ölçüde son görüntüyü izotropik çözünürlükte bir z yığını içine (bu durumda) 5 farklı görüşlerin dışında bilgilerden birleştirilir çok bakıslı görüntüleme, geliştirilebilir. Bu rakam Multiview Dekonvolüsyonun sonrası ağırlıklı ortalama füzyon ve görüntü aksine daha fazla kazanç ve çözünürlük sonra görüntü kalitesinde iyileşme göstermektedir. Şekil veri kümesi aracılığıyla farklı yönlerde iki optik dilimleri gösterir. Ayrıca, deconvolved veri kümesinden bir montaj zamanla optik fincan morfolojilerinden gösterir. Tüm zaman noktaları daha sonra Film 3'de gösterilmiştir. Şekil 5: tek bir görünümde ve multiv iki yöntem arasındaki görüntü kalitesi karşılaştırılmasıiew füzyon. (A) yan görünümü ve (B) dorsal görünümünden gösterilen tek görünüm verilerinin Bir adet optik dilim. Şerit eserler ve örnek içindeki derin sinyal bozulması belirgindir. Ayrıca kaynaşık verileri (CF) görünür resmin bir bölümü bu farklı görünüşünde yakalanan değildi. (C) aynı optik dilim, Multiview kaynaşmış veriler Lateral görünümde ve (D) dorsal görünümünde gösterilen şimdi. şerit eserler bastırılmış ve numune derin yapıların daha iyi çözülmesi olduğunu unutmayın. (E) aynı optik dilim şimdi Multiview Lateral görünümde ve (F) dorsal görünümünden gösterilen veriler deconvolved olarak. Bireysel hücre zarları ve çekirdekleri de ayırt edilebilir, böylece artan kontrast ve çözünürlük unutmayın. çözünürlük numune içinde özellikle derin bozulmaz. veri kümesi yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ile elde edildi. ab z yığınları1.5 mikron adım boyutu ile 100 mikron 20X / 1.0 W amacı ile 10 saat boyunca 10 dakika aralıklarla her bakışta elde edildi dışarı. Multiview füzyon ve Dekonvolüsyonun için giriş görüntüleri aşağı görüntü işleme hızlandırmak için 2 × örneklenmiştir. Multiview Dekonvolüsyonun 15 tekrarlamalar çalıştırmak. (G) montaj optik fincan aşamasına optik vezikül erken göz gelişimi sırasında morfogenetik olayları vurgulamak için deconvolved verilerden dorsal görünümü kırpılmış bir alanı göstermektedir. Başlangıçta içindeki kolon epitel olan optik vezikül iki kat, ayrı hücre popülasyonlarının farklılaşırlar. epidermis yakın uzak tabaka retina neuroepithelium (RN) ve nöral tüp yakın proksimal tabakası retina pigment epiteli (RP) dönüşür. RN uzatılmış ve invagine hücreler optik fincan (5:00 ile 1:40) oluşturmak için; Aynı anda RP hücreleri dümdüz. Yüzey ektoderm, WH bir lens (01:40) oluşturmak için indüklenirich invaginates sonra (05:00). Film 17 hpf başlar. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Tüm hücresel membranlar β-aktin ile etiketli: ras-GFP transgen ve tüm çekirdekler hsp70 tarafından etiketli: H2B-RFP transgen. Ölçek çubuğu 30 mikron temsil eder. FB ön beyin, LE objektif, OP koku plakod, RN retina neuroepithelium, RP retina pigment epiteli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Film 3: Optik fincan morfogenezisi tek bir görünümde ve Multiview füzyon iki yöntem ile gösterilen time-lapse film optik fincan aşamasına optik vezikül gelen optik fincan morfolojilerinden tam sürecini göstermektedir.. Lateral görünümde (üst) ve dorsal görüntüsü tek bir optik dilim (alt) tek bir optik dilim gösterir. Gelişmekte olan optik vezikül hücreleri nihayet iç retina neuroepithelium ve dış retina pigment epiteli ile yarım küre optik fincan oluşturmak için karmaşık düzenlenmeleri tabi. Bir lens yüzeyi ektoderm oluşturulmaktadır. Bu neuroepithelium birlikte invaginates ve optik fincan oturur. Tüm hücre zarının β-aktin ekspresyonu ile etiketlenmiştir: ras-GFP (yeşil), transgen ve çekirdekler HSP70 ile etiketlenmiştir: H2B RFP (kırmızı). Film yaklaşık 17 hpf başlar. Veri kümesi 20X / 1.0 W amacı ile her 10 dakikada elde edildi, yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ve yaklaşık 100 um yığınlarının az satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Discussion

veri toplama için 1. Kritik adımlar ve sorun giderme

Bir GFP ve örnek ifade RFP için tipik görüntüleme ayarları silindirik bir mercek tarafından oluşturulan ışık levha statik açıklanan mikroskop kurulumu, Tablo 3'te bulunabilir. İki aydınlatma amaçları hava lensler ve algılama amacı su daldırma lens. 20X / 1.0 veya 40X / 1.0 hedefleri ile 1.0 Yakınlaştırma 230 nm ve 115 nm piksel boyutu ve sırasıyla 441 x 441 mm veya 221 x 221 mikron bir görüş alanı elde edersiniz. 2: 1 oranı sınır merkeze varsayılan ışık sac kalınlığı kullanılması tavsiye edilir. 20X / 1.0 bu kalınlık 4.5 um ve 40X / 1.0 merkezinde um 3.2 için karşılık gelir. Görüntüleme hızı, birincil öncelik değilse, kanallar arasındaki floresans emisyonunun karışmasını önlemek için bir renkli örnek durumunda, ayrı parçaları kullanır. edinimi en yüksek hız z adım başına 50 milisaniye ile sınırlıdırZ-sürücünün hareket hızı. Amaç, örneğin durumunda, maksimum görüntüleme hızı elde etmektir z adım başına alınan tüm görüntülerin toplamı 50 milisaniye altında olacak şekilde, çift taraflı aydınlatma iki parça, pozlama süresi ayarlanmış olmalıdır. Sadece tek bir görüntü z adım başına elde edilir, diğer yandan, 50 ms daha kısa maruz kalma süresini ayarlamak için yararlı değildir.

1920 x 1920 görüntü boyutu

16 bit

Pivot üzerinde tarama

Online füzyon ile çift taraflı aydınlatma

10X / 0.2 aydınlatma amacı

20X / 1.0 W Plan-Apochromat algılama hedefi

Alan 1: Uyarma 488 nm tipik olarak 100 mW lazer% 2, 550 nm SP emisyon filtresi

Alan 2: Uyarma 561 nm tipik olarak 3% 75 mW lazer, 585 mil LP emisyon filtresi

100 milisaniye maruz kalma süresi kadar

Z yığın kalınlığı 50-100 mikron

Sürekli z sürücü modunda 1-1.5 mikron z adım boyutu

28.5 ° C 'de inkübasyon

Tablo 3: Ayarları Görüntüleme.

deneyden sonra örnek incelenmesi

Örnek yine Deneyin sonunda sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidir. İlk okuma olarak, bir Stereoskop altında numunenin kalp atışı kontrol edin. Keskin forseps bir çift ile örnek agaroz alınabilir ve görüntüleme etkilenen olup olmadığını kontrol etmek için daha da geliştirmek için inkübatör taşındı. Seçenek olarak ise, antikor boyama sabitlenebilir.

Montaj ve sürüklenme

Bölme s ozmolarite tutmak esastırAksi takdirde / şişme agaroz ve oluşacak numunesinin daha sonraki istikrarsızlık küçülen, yakın gömme agaroz ozmolarite Ç ÖZÜM. Bu nedenle, bölmeyi doldurmak için aynı çözeltisi (metilen mavisi olmayan E3 ortamı) kullanmak ve% 1 düşük erime noktasına sahip agaroz alikotları hazırlamak. onun jelleştirme özelliklerini kaybeder Buna ek olarak, en az 2 saat 70 ° C bir ısıtma bloğu içinde agaroz bırakmaz.

Bu embriyonun ısı şok yanıt veya ölüme yol açabilir olarak, çok sıcak agaroz içine balık embed etmeyin. Embriyoların sıcak agaroz etkisi hakkında emin değilseniz, kuyruk viraj olmadığını ve kalp hızı yavaşlatmak olmadığını kontrol edin. Bu durum ortaya çıkarsa, deney için farklı bir embriyo kullanın.

Örnek kısa (yaklaşık 2 cm) ile agaroz sütunun toplam uzunluğu tutun ve piston ucuna doğru yönlendirilmiş olan kafası ile zebrafish monte edin. Benzer şekilde, agaroz silindir capill ekstrüdeli mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır. Bu önlemler film boyunca örnek istikrarı sağlayacaktır. Bu büyük kırılma ve yansıma oluşturmadığı gibi cam kapiller kendisi ışık yoluna bulmuyor ki, aynı zamanda, agaroz sütun yeterince uzun olmalıdır.

numunenin başlangıç kayması agaroz silindirin kendisinin hacmi değişikliklerden kaynaklanır. pistonun Sürme bunun nedeni değildir. Bu nedenle, hamuru veya oje ile piston düzeltmek için yardımcı olmuyor. Embriyo çok nedeniyle doğal büyüme film sırasında konumunu değiştirmek olabilir. Buna göre, görüş alanının ortasında ilgi bölgesi ortalamak ve bu hareketleri karşılamak için kenarlarda bazı oda tutmak için tavsiye edilir.

ışık yolu gömme ortamındaki miktarında azalma

Doğru örnek yönlendirme mümkün olan en iyi görüntü kalitesini ¹⁵ ulaşmak için yardımcı olur. Genralli, uyarma ve emisyon ışık mümkün olduğunca az doku ve montaj medya yoluyla seyahat gerekir. optimal çözüm agaroz serbest montaj olduğunu. Bu ana kök fitayeldeki içine monte edilmiş ve yan kökler daha sonra tamamen jel kolon dışına büyümeye izin edildiği Arabidopsis yanal kök görüntüleme ^14, bir kurulum örneğin elde edildi. Agaroz ücretsiz montaj da iki gün üzerinde ¹² Tribolium böceği tam embriyogenez görüntüleme için geliştirilmiştir. Görüntü kalitesi iyileştirme bu durumda birincil motivasyon değildi. Tribolium embriyolar sadece yeterince uzun agaroz içinde hayatta yoktur. Kesinlikle gömme medya serbest montaj zebrabalıkları uzun süreli görüntüleme için elde edilmemiştir. Yine de, biz aslında yararlanabilirsiniz agaroz katılaşır, çoğu embriyolar tek agaroz derin bulunan göz ve gömme sütun yüzeye yakın olmanın ikinci gözle kılcal çapraz konumlandırılmış zaman. Tyüzeye yakın o göz üstün görüntü kalitesi sağlar ve bu nedenle tercihen görüntülü olmalıdır.

Agaroz konsantrasyonu ve uzun vadeli görüntüleme

montaj agaroz konsantrasyonu numunesinin stabilitesi ve buna oksijen embriyonun büyümesi ve difüzyon uyum imkanı arasında bir uzlaşmadır. % 1 'den daha yüksek bir agaroz konsantrasyonları kullanılarak numunenin stabilitesinde herhangi bir ek kazancı yoktur. Deney optimize etmek için bir başlangıç noktası olarak biz de% 1 agaroz içine monte edilmek için çok hassas olan daha genç 24 hpf embriyolar için uygundur% 0.6 agaroz, tavsiye ederim. Büyük embriyolar ve larvaları uyuşturan MS-222 konsantrasyonu yan etkileri ¹³ olmadan 200 ug / ml 'ye yükseltilebilir.

embriyo ve Caus büyümesini kısıtlar nedeniyle durumunda gelişmekte olan embriyolar, montaj agaroz tavsiye edilmez, daha uzun ± 12 saat görüntülüKuyruk deformasyonu es. Bu sorun ^13,39 sulamak için benzer kırılma indeksi ile FEP polimer tüpler içine embriyolar monte ederek zebrabalıkları için çözüldü. Fare embriyolan, diğer taraftan, içi boş silindir agaroz ⁴⁰ ya da bir şırınga ⁴¹ bağlı bir akrilik çubuğunun delik immobilize edilebilir. FEP tüp montaj borusunun duvar agaroz daha hafif biraz daha kırar çünkü olsa varsayılan yöntemi olarak tavsiye edilmez.

Işık levha hizalama

iyi görüntü kalitesi için, her deneyden önce otomatik ışık sac hizalama gerçekleştirmek için çok önemlidir. yakınlaştırma ayarları değiştirildi, özellikle amaçları çıkarıldı ya da farklı bir sıvı haznesi kullanılmıştır.

Aydınlatma

Işık tabakanın pivot tarama daima aktive edilmelidir. Büyük saçılma örneklerde, online f çift taraflı aydınlatma uygulamak için gerekli olanusion görüş alanı boyunca hatta aydınlatma elde etmek. Çift taraflı aydınlatma da embriyonun lens tarafından gelen ışık tabakanın kırılması olan göz görüntüleme, belirli bir sorunu azalır. Daha küçük, daha az saçılma örnekleri verimli yarıya görüntüleme süresini kısaltır ve çift taraflı aydınlatma ile karşılaştırıldığında biraz daha iyi görüntü kalitesi elde edebilirsiniz tek taraflı aydınlatma kullanılarak görüntülenebilir. İki aydınlatma silah için ışık yolları, her zaman farklıdır ve daha etkili bir seçilebilir olmasıdır. Ayrıca, her taraftan gelen iki ışık yaprak füzyon sonra bulanıklık hafif neden bir düzlemde, mükemmel asla. Büyüyen mikrotübül (Film 2) gibi çok hızlı hücre içi olaylar için, çift taraflı aydınlatma motion blur neden olabilir sırayla, elde edilen sol ve sağ taraftan aydınlatmalı görüntü beri, uygun değildir.

photobleachingve fototoksisite

Az fluorofor photobleaching genellikle LSFM önemli bir avantaj olarak söz edilir. Biz amaç hiç photobleaching olması gerektiğini iddia ediyorum. Canlı görüntüleme deneyde fark photobleaching varsa, numune tolere lazer maruz fizyolojik aralığının dışında zaten muhtemelen. eğirme disk mikroskop zebrafish embriyolar görüntüleme, bizim deneyim, yüksek fototoksisite bile belirgin bir şekilde flüoresan sinyal ağartıcılar önce embriyo gelişimini durak olabilir. az ya da hiç ışıkla ağartma gözlenmediği anlamına nedenle, LSFM görüntüleme ayarları ayarlanmalıdır. LSFM örnek nazik olsa da, daha sonraki veri analizi için yeterli gürültü oranı sinyal elde etmek için gerekli sadece kadar lazer gücü ve pozlama süresini kullanmak için isabetli olmuştur.

Z-yığını, zaman aralıkları ve veri boyutu

LSFM tarafından oluşturulan dosyaları genellikle çok büyük; Bazen terabayt aralığında. Görüntü kalitesi ve veri boyutu arasında bir uzlaşma yapmak çoğu zaman gereklidir. Bu, özellikle time-lapse satın almalar yığınlar ve aralıklarla z aralığı için geçerlidir. Z aralığı tanımlamak için, Z-yığın aracı sekmesi optimum düğmesi ideal veri kümesi daha sonra deconvolved olacak, özellikle de kullanılmalıdır. Bu komşu optik dilimler arasında% 50 örtüşme ulaşmak için boşluk hesaplar. Yine de, biraz daha büyük z aralıkları genellikle kabul edilebilir. Onlar z yığını yanı sıra son dosya boyutunu elde etmek için gerekli zamanı azaltmak. en uygun zaman örnekleme ilgi sürecine bağlıdır. genel göz için kalkınma 5-10 dk aralıklarla genellikle kabul edilebilir. Bazı yapılar otomatik olarak takip edilecek, sonraki zaman noktaları yeterince benzer olmalıdır.

floresan boncuk

Floresan boncuk öncelikle farklı görüşlere kayıt gibi fiducial işaretleri hizmetbirbirinin üzerine bir Multiview veri kümesinin. Her Kullanmadan önce iyice boncuk çözümleri girdap. Bu floresan boya kaybına yol açabilir olarak boncuk ısıtmayın. arakesit kayıt için uygun kordon konsantrasyonu deneysel olarak tespit edilmelidir. açıklanan eklenti her görünüm boyunca yaklaşık 1.000 algılanan boncuklar ile en iyi şekilde çalışır. Daha büyük (500 nm ya da 1000 nm) taneleri daha küçük (daha az 500 nm) boncuk daha sağlam tespit edilir. Büyük taneler daha parlak ve örnek yapıların yanlış pozitif algılamaları olmayan bölüm daha kolay olmasıdır. Daha büyük taneciklerin dezavantajı, nihai erimiş ve deconvolved görüntüde çok önemli olmasıdır. Her yeni floresan işaretleyici için, uygun boncuk büyüklüğü ve floresan emisyonu optimize edilmesi gerekir. Şekil 5 ve Film 3 den örnek bir örnek vermek gerekirse, 100 nm yeşil emisyon boncuk zar-GFP kanalda çok fazla yanlış pozitif algılamalar verdi ama 1000 nm kırmızı emisyon boncuklar sağlam numune içinde çok az olumlu algılamalar ile H2B-RFP kanalında tespit edildi. boncuk algılama floresan işaretleyici ile kanalda başarısız olursa, sadece boncuklar içeren ayrı bir kanal elde edilebilir, ama bu çok pratik değildir. Alt çözünürlükte boyutlu boncuk deconvolution (Şekil 2C-D) için kullanılabilir mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (PSF), doğrudan okuma verir. Kayıt ve füzyon daha iyi daha büyük boncuklar (örneğin 1000 nm) ile çalışıyorsa, PSF ayrı bir görüntü alt çözünürlük, örneğin, 100 nm boncuklar ile elde edilebilir. renkli boncuklar kullanarak çok kanallı edinim kayıt sırasında ve kanallar bindirme mükemmel olduğunu doğrulamak için yararlıdır.

sonraki bakıslı kayıt ve füzyon olmadan tek bir görünümden görüntüleme sırasında floresan boncuk ilavesi gerekli değildir. Bununla birlikte, bu durumlarda bile, boncuklar inisiyatif sırasında yararlı olabilirl ışık levha ayarı ışık tabakanın kalitesi kontrol etmek ve genel olarak optik sapmaları ortaya çıkarmak için. Böyle optik sapmaları hasarlı veya kirli hedefler, agaroz odası veya homojen kirli pencere gibi çeşitli kaynaklardan kaynaklanabilir. Boncuklar da çok bakıslı kayıt Fiji eklentisi ²⁰ tarafından sürüklenme düzeltilmesi için de kullanılabilir.

Multiview

Multiview yeniden amaçla, birbirine karşıt değil görünümler 3, böylece 5 ve tek sayıda elde etmek daha iyidir. PSFs farklı yönlerden görüntülü çünkü bu dekonvulasyon artırır. Görünümler arasında yeterli örtüşme olduğu zaman atlamalı edinimi başında onaylamak için de önemlidir. Bu en iyi derhal ilk kez noktasında görüşlerini başarıyla kaydedilebilir teyit, yani ampirik yapılır. Multiview edinme amacı çözünürlüğü artırmak için zamanBüyük bir saçılma numunesinin bir görüntünün, her görünümde tüm numune görüntü için tavsiye edilmez, ancak sinyal bozulur numune, merkezi etrafında durdurmak için. numunenin ikinci yarısından itibaren düşük kaliteli edinme Multiview yeniden yararlı bilgiler eklemek olmaz.

veri işleme 2. Kritik adımlar ve sorun giderme

Şu anda, iyi belgelenmiş ve benimsemeye nispeten kolay olan bir ışık sac mikroskop Multiview veri işleme için çeşitli olasılıklar de bulunmaktadır. Biz Fiji ³² (Stephan Preibisch yayınlanmamış, uygulanan açık kaynak kodlu bir yazılım Multiview rekonstrüksiyon uygulamasını kullanabilirsiniz Bağlantı 1a ve Link1b Malzeme Listesi'nde). Bu eklenti, önceki SPIM kayıt eklentisi ²⁰ önemli bir yeniden tasarımı olduğunu gözdenBigDataViewer ve XML ve SPIM kayıt iş akışı ile HDF5 formatı ³³ (Şekil 1B, entegre Schmied ve ark. ⁴² tarafından Linki 2 , Link 3 ). Bu uygulama aynı zamanda önemli ölçüde işlem ⁴³ hızlandırır yüksek performanslı bilgi işlem küme için adapte edilebilir. Bu Multiview tescil başvurusu aktif daha da geliştirilmesi ve geliştirmeye devam ediyor. Açıklanan yazılım için sorunları veya özellikleri istekleri halinde, ilgili GitHub sayfalarında (on sorunları bulunun Bağlantı 4 Multiview İmar ve Bağlantı 5 BigDataViewer için).

İkinci seçenek mikroskobu ile birlikte mevcut ticari yazılım kullanmaktır. Bu çözüm iyi çalışıyor ve istihdam farklı görüşlere kaydetmek için floresan boncuklar kullanarak aynı prensip. Ancak, hızlı BigDataViewer olduğu gibi tüm veri kümesini görselleştirmek için seçeneği yoktur. Ayrıca yazılım küme adapte ve yazılım için ek lisans satın alınmadığı sürece diğer kullanıcılar için ayrıca işlem blokları mikroskop edilemez.

Ayrıca bir açık kaynak kodlu bir yazılım Üçüncü seçenek, son zamanlarda Keller laboratuarında ⁴⁴ tarafından yayınlanan ve işleme ve hafif levha verilerinin aşağı analizi için kapsamlı bir çerçeve vermektedir. Bu yazılım, bu nedenle örnek yaklaşık flüoresan boncuklar mevcudiyetini gerektirmez, çok-füzyon gerçekleştirmek için örnek içinde bilgileri kullanmaktadır. Ama aynı zamanda bu görüntüleme görünümleri (hedefler) ortogonal yönünü varsayar, bu yüzden keyfi açılardan ⁴⁴ elde edilen veriler için kullanılamaz.

Donanım gereksinimleri

ntent "> işlenmesi için kullanılan donanım görüntüleri kazanılması sonraki analiz daha hızlıdır. Önümüzdeki asıl deney yeterli depolama kapasitesi ve mevcut veri işleme için açık bir boru hattı, olmak zorunda. Tablo 4'de bulunabilir ve kolay işlenmemiş verilerle sular altında almak için. birleştirilmiş görünümlerde, maksimum yoğunluğu projeksiyonları veya küresel projeksiyonlar ⁴⁵ gibi tüm ham görüntüleri, daha ziyade bir kırpılmış sürümü veya işlenmiş görüntüleri saklamak için sık sık gerçekçi değildir.

İşlemci	İki Intel Xeon İşlemci E5-2630 (Altı Çekirdekli, 2.30 GHz Turbo, 15 MB, 7.2 GT / sn)
Bellek	128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Sabit sürücü	4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7.200 rpm) Sabit Disk
HDD Kontrol	PERC H310 SATA / SAS ConDell Precision için troller
HDD Yapılandırma	C1 SATA 3.5 inç, 1-4 Sabit Sürücüler
Grafik	İkili 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (/ 2 DP ve 1 w 2 kart DVI-I her biri) (2 DP-DVI ve 2 DVI-VGA adaptörü) (MRGA17H)
Ağ	Intel X520-T2 Çift Bağlantı 10 GbE Ağ Arabirim Kartı

Tablo 4: Donanım Gereksinimleri.

Veri işleme hızı

veri işleme için gerekli zamanlı veri boyutları ve kullanılan donanım bağlıdır. Tablo 1'de, biz 4 görünümleri ve 2 kanallı 1 zaman noktasında oluşan bir örnek 8.6 GB Multiview dataset işleme önemli adımlar için gerekli zaman genel bir bakış sağlar.

işleme step	Zaman	protokol adım
Hdf5 olarak kaydetmeniz	6 dakika 30 saniye	6.3
Faiz Puan Algılama	20 sn	6.4
faiz noktalarını kullanarak Kayıt Ol	3 sn	6.5
İçerik tabanlı çok bakıslı füzyon	4 saat	7.2
Multiview Dekonvolüsyonun (CPU)	8 saat	7.3
Multiview Dekonvolüsyonun (GPU)	2 saat	7.3

Tablo 1: Bilgi İşlem Zamanı.

bakıslı yeniden inşası için giriş veri biçimleri

Fiji Eklentisi Multiview İmar .czi, .tif ve ome.tiff formatlarını destekler. .czi biçimde veri yapısı nedeniyle, sürekli veri setleri değildirön işleme olmadan destekledi. Süreksiz kayıt (örneğin örnek kayması nedeniyle pozisyonları yeniden düzenlemek için) yeniden başlatılması gerekiyordu anlamına gelir. Bu durumda, .czi dosyaları .tıf olarak resaved gerekir. .tif için her görünüm dosyaları ve aydınlatma yönü ayrı bir dosya olarak kaydedilmiş olması gerekir.

piksel boyutunda Kalibrasyon

Mikroskop işletim yazılımı seçilen hedefe dayalı xy piksel boyutu için kalibrasyon hesaplar. Bununla birlikte, z piksel boyutu adım boyutu ile, bağımsız olarak tanımlanır. Yanlış bir amaç yazılımında belirtilmiştir z oranı xy yanlış ve kayıt başarısız olur.

ilk kayıt

Veri kümesini tanımladıktan sonra kayıtlarının 1 numara olacak ve faiz noktalarının sayısı ViewSetup Explorer 0 olacaktır. ilk kayıt veri kümesi kalibrasyonunu temsil eder. numara o Hemf kayıtları ve faiz noktaları işleme sırasında artacaktır.

faiz noktalarının tespiti için numune aşağı

örnekleme aşağı kullanarak dosyaları yükleme beri, tavsiye edilir ve segmentasyon çok daha hızlı olacaktır. Saptama parametreleri dolayısıyla farklı aşağı örnek ayarları arasında algılama ayarlarını transferi, aşağı örnekleme bağlı olarak değişebilir mümkün değildir unutmayın için ne kadar önemli olduğunu.

faiz noktalarının tespiti

Onlar oldukça kaydı engel yok, çünkü hatta bazı yanlış pozitif algılamalarını elde fiyata her görünümde mümkün olduğunca çok sayıda gerçek boncuk olarak segmente tavsiye edilir. Az sayıda da eğer sahte algılamalar, (ilgi noktaları Kayıt bakınız) kayıt sırasında hariçtir. Ancak, masif yanlış pozitif algılamalar algoritması bir sorun teşkil etmektedir. Bu sadece algılama için performansını düşürür veKayıt, bu segmentte çok daha uzun görüntü alır yanı sıra görünümler arasında bu boncuklar karşılaştırmak, ama aynı zamanda kayıt doğruluğunu azaltır çünkü. Bu daha sıkı tespit parametreleri kullanılarak ele alınabilir. Ayrıca, boncuk (bir boncuk Şekil 1E üzerinde yani çoklu algılamaları) segmentasyon üzerinde kayıt için zararlı olduğunu ve kaçınılmalıdır.

ilgi noktaları Kayıt

birbirinin üzerine incelemeler kaydolmak için, her bir görünümünde, her bir tanenin konumu, en yakın üç komşu taneler ile ilgili olarak pozisyonu ile tanımlanmaktadır. Bu takımyıldızları yerel geometrik tanımlayıcısı oluşturan ve görünümler arasında her boncuk karşılaştırarak izin verir. iki görüş arasındaki tanımlayıcısı eşleşen Boncuk sonra aday yazışmalar olarak kabul edilmektedir. Bu sadece yerel tanımlayıcılar genellikle her boncuk için benzersiz olan rasgele dağıtılmış boncuk için çalıştığını unutmayın.Böyle bir kayıt numunedeki çekirdeklerin gibi diğer yapılar da kullanabilirsiniz. Bununla birlikte, örnek sigara rastgele dağıtılır çekirdekleri, tespit etmek için, başka yöntemler ^20,21 uygulanır.

Aday yazışmalar sonra yanlış pozitif ekarte etmek için RANSAC ³⁶ karşı test edilir. Her yazışma birbirinin üzerine görüşlerini aktarma için bir dönüşüm modeli öne sürüyor. aykırı, farklı bir her noktayı olur oysa gerçek yazışmalar olasılıkla, bir dönüşüm modeline kabul ediyorum. Gerçek yazışmalar daha sonra iki karşılaştırıldığında görünümler arasında bir afin dönüşüm modeli hesaplamak için kullanılır. Iteratif optimizasyon algoritması ile global optimizasyon sonra tüm görünümleri görünümleri ^20,21 arasında minimal deplasman amacı ile ilk görünümü üzerine kayıtlı sırasında, yürütülür.

Time-lapse kayıt

hareket nedeniylemikroskop sahne agaroz ve kesin olmayan motorlu hareketinin ment, her yığının konumu zamanla orta değişir. Bireysel zaman noktasında kayıt, bu zaman noktasında görüşleri arasındaki farkı kaldırır ise, time-lapse aynı zamanda bir bütün olarak tescil edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla, her bir zaman noktası referans zaman noktası üzerine kaydedilir.

Referans zaman noktası

birçok zaman noktaları ile bir zaman serisi işlenirse kordon yoğunluklarının ağartmaya zamanla bozulduğundan gösterebildiği için, Örnek zaman noktası zaman serisinin ortasına genellikle referans olarak seçilir. Bu referansta üzerinde, faiz noktası tespiti, tescili, sınırlayıcı kutunun ve füzyon için parametreler tespit edilebilir. Bu parametreler daha sonra, her bir zaman noktası için özel bir dönüşüm modeli hesaplamak için bütün zaman atlamalı uygulanır. Time-lapse kayıt sırasında, diğer tüm zaman noktaları da regist vardırBu referans zaman noktasında üzerine mekansal göz önünde bulundurmuştur. Böylece tüm kayıt için sınırlayıcı kutu parametreleri bu özel zaman noktasında esasına dayanmaktadır.

Çok Kanallı kayıt

birden fazla kanal görüntüleme yaparken, ideal olarak aynı floresan boncuk tüm görüntülü kanallarda görünür olmalıdır. algılama ve kayıt daha sonra dikkate dönüşüme farklı ışık dalga boyu etkisini alır tek tek her kanalda, yapılabilir. boncuklar tüm kanallar görünmez veya boncuk bir kanalda çok fazla görüntü hakim ve diğer kanal (lar) çok loş çünkü çoğu zaman bu, mümkün değildir. Tipik çözüm sadece tespit ve tescil ve edinsel dönüşüm modeli için bir kanal görünür boncuk kullanmak (yani algılama, kayıt ve time-lapse kayıt sonra) sonra Fiji> Eklentiler> Multiview Reconstr diğer kanallara uygulanıruction> Toplu İşleme> Araçlar> Yinelenen Dönüşümler. Açılır menüde diğer kanallara seçin Bir kanalın dönüşüm uygulayın için. Aşağıdaki pencerede XML seçin ve Tamam'a tıklayın. Sonra Kaynak kanalı olarak boncuk içerir ve Hedef kanalı olarak boncuklar olmadan kanal (lar) ı seçmek kanalı seçin. Hangi Duplicate için dönüşümleri tüm dönüşümleri ve OK tuşuna basın değiştirin kullanın. Dönüşümler sonra tüm diğer kanallar kopyalanabilir ve XML kaydedilir. MultiView İmar Uygulama yeniden başlatın ViewSetup Explorer'da yeni dönüşümleri görmek için.

Sınırlayıcı kutu

Birden fazla görüş füzyon hesaplama çok yoğundur. Ancak, büyük resimler genellikle örnek, aynı zamanda çevresinde boncuk sadece karşılamak için elde edilir. Kayıt parametresi kezboncukları elde edilir, bu görüntünün bir parçası olarak, artık yararlıdır. Bu nedenle, füzyon etkinliğini arttırmak için, numuneyi içeren görüntü yığınlarının sadece parçaları bir araya birleştirilebilir olmalıdır. faiz (sınırlayıcı kutu) bir bölge örneği içerecek şekilde tanımlanır ve mümkün olduğunca çevredeki agaroz kadar az olmalıdır. Sınırlayıcı kutu hacim 1634 × 1746 × 1632 piksel indirgenir ve bellek gereksinimleri azalır oysa Şekil 2'de örneğin 2229 × 2136 × 2106 piksel ile tüm birimdeki bir ağırlıklı ortalama füzyon, RAM 38196 MB gerektirecektir 17.729 MB.

İçerik tabanlı çok bakıslı füzyon

Multiview verilerini eritme içinde zorluk görünümleri genellikle aniden sona erdirmek ve aynı voksel için aynı görüntü kalitesini içermiyor olmasıdır. görüş basit ortalama nedenle karıştırma eserler ve gereksiz görüntü bozulmasına yol açacaktır. İçerik tabanlı Multiview fu yon dikkate Bu sorunların her ikisi alır. Bir resim biter diğeri başlar ve ikinci, yerel görüntü kalitesi değerlendirir ve füzyon ²¹ daha yüksek görüntü kalitesi daha yüksek ağırlıkları uygular nerede Birincisi, farklı görüşlere karıştırır. Tek bir görünüme kıyasla xy sinyalin hafif bozulma (Şekil 2E-H, Şekil 5A-D) z çözünürlükte bir iyileşme var.

Multiview dekonvolüsyon

Multiview Dekonvolüsyonun görüş füzyon elde etmek için başka bir yaklaşımdır. Bu yöntemle farklı görüşlerin de PSFs mikroskop optik tarafından convolved olmuştur görüntüyü kurtarmak için dikkate alınır. Bu yöntem büyük ölçüde görüntü bulanıklığını ortadan kaldırmak ve sinyal ³¹ (Şekil 2C-D, Şekil 2I-J, Şekil 5E-G, Film 3) çözünürlüğünü ve kontrastı artırarak görüntü kalitesini artırır.

ve_content "> Dekonvolüsyon hesaplama açısından çok yoğundur ve böylece işlem için bir grafik işlemcisi, bu işlem hızı artar kullanılarak (Tablo 1 e bakınız). Ayrıca, aşağı doğru örneklenen veri ters evrişim yerine getirmek için gerekli olabilir. Aşağı numune için, Fiji> Çoklu görüntü Tadilat'tı kullanabilirsiniz > Toplu İşleme> Araçlar> Uygula Dönüşümler. Bu .xml dosyasına kaydedilir görünümlerde yeni dönüşüm modeli uygulayacaktır.

BigDataViewer ve BigDataServer için HDF5 dosya biçimi

BigDataViewer ³³ terabayt büyüklüğünde verilerin kolayca görülmesini sağlar. Nasıl BigDataViewer kontrol etmek için, Tablo 2'de özetlenmiştir. Programının temel işlemin bir screencast orijinal yayın ³³ bir destek olarak da mevcuttur. BigDataViewer görüntü verilerini içeren meta verileri içeren bir .xml dosyası, ve bir hdf5 dosyası, üzerinde odaklanmaktadır. görüntü verisi pres vardır3D blokları çoklu çözünürlük seviyelerinde hdf5 ENT. Tam çözünürlükte yüklenmeden önce çoklu çözünürlük seviyeleri, düşük çözünürlükte daha hızlı veri görselleştirme için izin verir. gerektiğinde bireysel bloklar sadece belleğe yüklenir. Böylece, hdf5 görüntü formatı BigDataViewer ³³ ile veri doğrudan ve hızlı görselleştirme sağlar. dosyaların yüklenmesi daha verimli bir şekilde gerçekleştirilir çünkü, aynı zamanda işleme hızlandırır. o kesinlikle işleme için gerekli olmamasına karşın, bu nedenle, biz, bu biçime veri kümesi kaydetmeyi öneririz. Veri formatı daha fazla açıklama için, bakınız Bağlantı 3 . Ayrıca, veri setleri işbirlikçileri veya BigDataServer ³³ (kullanarak kamuoyu ile paylaşılabilir Linki 6 ).

<td> etkisi

anahtar
F1	Bir BigDataViewer kısa tanımı ve temel çalışma ile Yardım gösterir
<> Veya fare tekerleği	z hareket
Yukarı ve aşağı ok	yakınlaştırma ve uzaklaştırma
sağ tıklayın ve sürükle	izleyicide örnek hareket
sol tıklama ve sürükle	imlecin çevresinde örnek döner
izleyici veya Tab ve sol veya sağ ok altındaki kaymak	Zaman ekseni üzerinde hareket
ayrıca vardiya basarak	Herhangi bir eksen boyunca hızlı hareket veya rotasyon
x ve ardından sol ve sağ ok	x ekseni etrafında döner
y ve daha sonra sol ve sağ ok	y ekseni etrafında döner
z ve daha sonra sol ve sağ ok	z ekseni etrafında döner
vardiya x	x ekseni boyunca görünümü yönlendirir
vardiya ve y	y ekseni boyunca görünümü yönlendirir
vardiya ve z	z ekseni boyunca görünümü yönlendirir
ben	farklı enterpolasyon modları arasında geçiş yapar (yani en yakın komşu ve trilinear)
s veya Ayarlar> Parlaklık ve Kontrast	kanalları, parlaklık ve kontrast rengini değiştirir
F6 veya Ayarlar> Görünürlük ve gruplama	Görüntülenen grupları değiştirir sayı tuşları ile gruplar farklı grupları bindirilirken ve aramadan gruplama sağlar
F10 veya Araçlar> Kayıt Filmi	Şu anda görüntülenen dilim bir zaman serisi elde

Tablo 2: Büyük Veri Görüntüleyici.

LSFM tarif edilen uygulama 3. sınırlamalar

Düşük hacimli

Tipik LSFM deneyde yalnızca deney için bir örnek olarak görüntülenir. Yine, bizim deneyim, yararlı birçok bilgi bu tek numuneden elde edilebilir. Birden çok embriyo yüksek verim görüntüleme en son örnek konumlandırma ve dönme özgürlüğü pahasına olmakla birlikte, tipik olarak, ana inşa LSFM kurulumları ^46-48 elde edilmiştir.

dokulara Yetersiz penetrasyon derin

Zebra balığı embriyolar saydam olsa bile dolayı saçılma ve emilim dokuda daha derin görüntüleme yaparken, elde edilen görüntü kalitesi hızla kötüye gidiyor. Kısmen bu örnek tarafından yayılan floresan saçılması ve emilimi bir etkisi ve cari kurulumda düzeltilemez. düzensiz görüntü kalitesi diğer bir kaynağı düzensiz aydınlatma olduğunu. TO ışık levha sağ veya sol taraftan olay ve şerit eserler ve bulanıklık sonuçlanan yolunda onu kırmak, herhangi bir nesne olduğunu. çift taraflı aydınlatma ve Multiview füzyon son resimde eserler azaltabilir. Son olarak, görüntü kalitesi nedeniyle kenarlara doğru daha kalın hale geliyor ışık levha, doğal geometrisine görüş alanının marjı doğru biraz daha kötü olma eğilimindedir.

Sınırlı kimyasal manipülasyon

ilaç ya da inhibitörlerin kullanımı zebrabalıkları araştırmalarda yaygın olarak bulunmaktadır. bu ilaç mikroskop kullanımı nedeniyle numune odası ve aynı odayı paylaşan enstrümanın diğer kullanıcıları, düşüncelerin büyük hacmi, sınırlıdır. İlaç deneyleri adanmış bir ekstra odasını kullanarak bu sorunu çözebilir. cam boncuklar ile kısmen odasını doldurmak gerekli sıvının hacmini azaltır.

hiçbir photomanipulation

currently bu mikroskopta Fotoçevrim veya lazer ablasyonu gibi lokalize optik manipülasyon imkanı yoktur. Bununla birlikte, ana inşa kurulumları gibi özel uygulamalar için kullanılabilir.

4. Önemi ve gelecekteki uygulamalar

LSFM canlı embriyoların büyük hacimli hızlı görüntüleme için bugüne kadar mevcut en iyi yöntemdir. konfokal mikroskop akla deneylerin çoğu da bahsedilen avantajları ile hafif bir levha mikroskobu gerçekleştirilebilir. göz gelişimi görüntüleme durumunda, LSFM hızı önemli parametre değildir. Bunun yerine, örnek konumlandırma düşük fototoksisite ve esneklik belirleyici faydaları vardır.

LSFM verileri iyi bir ters evrişim sonuçlar elde etmek için yardımcı olur ve aynı zamanda otomatik bir görüntü analiz ve nesne izleme için yararlı olan yüksek SNR sahiptir. Sonuç olarak, LSFM embriyonik gelişim ve Overa üzerinde ölçülebilir verilerin üretilmesi için harika bir araçtırLL hücresi ve sonraki modelleme ve ilgili yöntemler fiziksel açıklamaları için doku özellikleri.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

Materials

Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm	Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer.

Referências

Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).
Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).
Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).
Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
Pampaloni, F., Chang, B. -. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).
Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. , 193-215 (2014).
Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).
Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).
Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).
Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. , 028308 (2015).
Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).
Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).
Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).
Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).
Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. , (2013).
Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. , 1-11 (2013).
Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).
Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).
Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).
Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).
Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , 23.1-23.10 (2002).
Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).
Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).
Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1 (1), 2 (2006).
Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).
Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).
Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).
Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).
Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5 (6), e01751-14-8 (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Declarações

Acknowledgements

Materials

Referências

Tags

Play Video

Citar este artigo

View Video

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Declarações

Acknowledgements

Materials

Referências

Tags

Play Video

Citar este artigo

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below