Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
Morphogenese ist der Prozess, den Embryo und zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsformen treibt die Ontogenese aus einer befruchteten Eizelle zu einem reifen vielzelligen Organismus. Die morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung der Tiere können durch die Abbildung von intakten lebenden Proben 1-3 analysiert am besten. Dies ist, weil eine solche ganze embryo Abbildungs bewahrt alle Komponenten, die Entwicklung, einschließlich Gradienten von Signalmolekülen, extrazelluläre Matrix, Gefßsystem, Innervation sowie mechanischen Eigenschaften des umgebenden Gewebes treiben und zu regeln. Um die Skalen überbrücken, an der Morphogenese auftritt, haben die schnellen subzelluläre Ereignisse auf eine Minute Zeitskala im Zusammenhang mit der Entwicklung des gesamten Gewebes über Stunden oder Tage erfasst werden. Um all diese Anforderungen zu erfüllen, eine moderne Umsetzung 4 der orthogonalen Ebene Beleuchtung Mikroskop 5 wurde entwickelt. Ursprünglich war es das Selective Plane Illumination Microscopy (SPI benanntM) 4; nun eine allumfassende Begriff Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) wird in der Regel eingesetzt. LSFM ermöglicht Bildgebung mit hoher Zeitauflösung, während Induktion weniger als Phototoxizität Laser – Scanning oder Drehscheiben – konfokale Mikroskope 6,7. Heutzutage gibt es bereits viele Implementierungen der Grundlichtbogen Beleuchtungsprinzip , und es hat 8-11 eine Vielzahl von Proben und Verfahren zur Bild bisher unzugänglichen Forscher verwendet.
Wir würden zunächst einige wesentliche Vorteile von LSFM gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Ansätze hervorheben:
Um aussagekräftige Ergebnisse aus Live-Bildgebung mikroskopische Experimente zu erwerben, ist es wichtig, dass die Beobachtung nur minimal die Probe beeinflusst. Allerdings sind viele Organismen Zebrabärbling einschließlich sehr anfällig für Laserlicht ausgesetzt werden, ist es schwierig zu Bild machen sie in einem konfokalen Mikroskop mit hoher Zeitauflösung ohne Phototoxizität effekte wie ins Stocken geraten oder Entwicklung 6,7 verzögert. LSFM ist derzeit der Fluoreszenz – Imaging – Technik mit den am wenigsten störenden Auswirkungen auf die Probe 7. Da das dünne Blech Laserlicht nur den Teil der Probe beleuchtet, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird, ist das Lichtblatt-Mikroskop Photonen sehr effizient zu nutzen. Folglich ermöglicht die geringe Lichtbelastung für längere Zeitraffer Beobachtungen von gesünderen Proben, zB 17.12. Darüber hinaus dank der minimalen Invasivität LSFM, die Anzahl der erfassten Bilder wird nicht mehr durch diktiert, wie viel Licht die Probe tolerieren kann, sondern durch, wie viele Daten verarbeitet und gespeichert werden.
In die gleiche Richtung von der Probe in der Nähe von physiologischen Bedingungen zu halten, kommt LSFM mit alternativen Probenmontagestrategien gut geeignet für Live-Embryonen. In LSFM Techniken werden die Embryonen typischerweise innerhalb einer dünnen Säule von niedrigen Prozentsatz Agarose eingebettet. Die mounting in Agarose Zylindern ermöglicht die vollständige Rotationsfreiheit, so kann die Probe aus dem perfekten Winkel beobachtet werden (in LSFM als Ansicht bezeichnet) und aus mehreren Ansichten gleichzeitig. Die Multi-View-Bildgebung und die anschließende Multi-View-Fusion ist von Vorteil, besonders für große, Verstreuen Proben und ermöglicht es ihnen, mit hohen, isotropen Auflösung zu erfassen. Eine Zusammenfassung der anderen möglichen LSFM Montagestrategien können im offiziellen Mikroskop Betriebsanleitung zu finden, in dem Kapitel über die Vorbereitung durch das Labor von E. Reynaud geschrieben Probe. Es ist eine Lese empfohlen, insbesondere wenn das Ziel zur Bild verschiedenen Proben als hier beschrieben.
Die Bilderfassung in LSFM ist weites Feld, kamerabasierte, als konfokales Mikroskop zu Laser-Scanning-Gegensatz. Dies führt zu einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) für die erfassten Bilder und können sehr schnell (zehn bis hundert Bilder pro Sekunde) betragen. Die hohe Empfindlichkeit von LSFM ermöglicht eine weitere Abbildung von schwach fluoreszierenden samples, wie Transkriptionsfaktoren an die endogenen Spiegel 18 zum Ausdruck gebracht oder in naher Zukunft, endogenen Proteinen unter Verwendung von CRISPR / Cas9 markiert. Die hohe SNR ist auch wichtig für eine erfolgreiche nachgeschalteter Bildanalyse. Die hohe Geschwindigkeit ist nicht erforderlich, nur eine schnelle intrazelluläre Vorgänge zu erfassen, sondern auch auf Bild, um das gesamte Embryo aus mehreren Ansichten schnell genug. Eine nahtlose Verschmelzung der mehreren Ansichten kann nur erreicht werden, wenn das beobachtete Phänomen während der Erfassung dieser verschiedenen z-Stacks nicht aus getrennten Ansichten kommenden ändern.
Die Vorteile der LSFM typischerweise nicht auf Kosten der Bildqualität kommen. Die laterale Auflösung von LSFM ist etwas schlechter als die Auflösung eines konfokalen Mikroskops. Dies liegt daran, die Erkennungsziele in LSFM niedrigeren numerischen Apertur verwendet (in der Regel 1,0 oder weniger) im Vergleich zu 1,2-1,3 Wasser oder Silizium Tauchziele auf Standard-konfokalen Setups. Zusätzlich aufgrund der breiten Felderkennung in LSFM (Absence eines Pinholes), gibt es mehr out-of-focus Licht im Vergleich zu einem konfokalen Mikroskop. Die Menge an out-of-focus Licht wird durch die Lichtbogendicke bestimmt. Dennoch werden diese Nachteile durch die höhere SNR in LSFM kompensiert. In der Praxis führt dies in ähnlicher Qualität Bilder im Vergleich zu beispielsweise sich drehende Scheibe konfokalen Nahme 15. Folglich ermöglicht diese zuverlässige Extraktion von Merkmalen wie Zellmembranen oder Zellkerne, beispielsweise für die Zelllinie 15,19 Tracing.
Die axiale Auflösung von LSFM bestimmt wird, zusätzlich zu dem Erfassungsziel, durch die Lichtbogendicke. Die axiale Auflösung von LSFM kann in einigen Fällen übertreffen die Auflösung der konfokalen Mikroskope. Zuerst kommt die Verbesserung der Auflösung, wenn die Lichtbogen dünner als die axiale Auflösung des Detektionsziel ist, die typischerweise für große Proben mit geringer Vergrößerung Ziel abgebildet auftritt. Der zweite Weg, wie die LSFM ach kannIEVE bessere axiale Auflösung ist die Multi-View-Fusion, bei der die hohe xy Auflösung von Informationen aus verschiedenen Ansichten in einem Bildstapel kombiniert wird. Die sich ergebende zusammen Stapel weist eine isotrope Auflösung 20,21 die Werte der Auflösung in der seitlichen Richtung nähern. Die Strategie zur Registrierung der mehrere Ansichten auf einander in diesem Artikel beschrieben wird , basiert auf der Verwendung fluoreszierenden Polystyrol – Kügelchen als Treuhänder in der Agarose eingebettete Marker um die Probe 20,21.
Als Ergebnis der LSFM Kommerzialisierung Diese Technik ist jetzt zu einer breiten Gemeinschaft von Wissenschaftlern 22 zur Verfügung. Daher ist die Motivation, dieses Protokoll zu schreiben diese Technologie zugänglich Entwicklungsbiologen praktische Erfahrung in LSFM fehlt zu machen und diese Wissenschaftler zu erhalten begonnen mit dieser Technologie mit ihren Proben. Unser Protokoll verwendet das kommerzielle Lichtblatt-Mikroskop, das eine vom Konzept her einfach Mikroskop t darstelltHut ist leicht zu bedienen. Wir möchten zusätzlich andere neue Protokolle zu erwähnen , für die Abbildung Zebrabärbling mit selbstgebauten LSFM Setups, die geeignet sein könnten , insbesondere Fragen 23-25 zu beantworten. Ein weiterer Eintrag Option LSFM sind die offenen Plattformen 26,27, die die Open – Access – Prinzipien verwenden Lichtblatt – Mikroskopie zu einer breiteren Gemeinschaft zu bringen. Die Dokumentation sowohl der Hardware als auch die Software-Aspekte können bei http://openspim.org und https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ finden.
In diesem Protokoll verwenden wir das Teleostier Zebrabärbling als Modellsystem Entwicklungsprozesse mit LSFM zu studieren. Morphogenese des Zebrabärbling Auge ist ein Beispiel, das viele der Vorteile von LSFM unterstreicht. LSFM hat bereits in der Vergangenheit verwendet worden 29,30 Augenentwicklung in Medaka 28 und in Zebrabärbling zu untersuchen. In einem frühen Stadium der Entwicklung des Auges ist es kompliziert, den Embryo richtig für konventionelle Mikroskopie zu orientieren,wird als sperrig yolk nicht der Embryo erlauben, auf der Seite mit dem Auge, das Ziel zu liegen gegenüber. Jedoch mit LSFM in eine Agarose-Säule Befestigungs kann die Probe reproduzierbar positioniert werden. Zusätzlich wird während des Übergangs von Augenblase zur Exkavation Stufe erfährt das Auge Haupt morphogenetic durch Wachstum begleitet Umlagerungen, die eine große z-Stack und einen großen Sichtfeld erfordert die Erfassung. Auch für diese Herausforderungen ist LSFM überlegen gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung. Der Prozess der Exkavation Bildung ist dreidimensional, daher ist es schwer, durch Abbilden von einer Ansicht allein zu erfassen und zu visualisieren. Dies macht Multi-View-Bildgebung mit isotropen Auflösung von Vorteil. Nach Augenbecher Bildung, wird die Netzhaut-Laserbelichtung zunehmend empfindlich. Somit ist die geringe Phototoxizität assoziiert mit LSFM ein großer Vorteil für die Langzeitbildgebung.
Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Bildgebung von ein bis drei Tage alten Zebrafischembryonen einnd Larven mit Schwerpunkt auf der Entwicklung des Auges. Unsere Methode ermöglicht die Aufnahme von Zeitraffer-Filme auf 12-14 h mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verdecken. Wichtig ist, zeigen wir auch eine Pipeline für die Datenverarbeitung, die ein wesentlicher Schritt in LSFM ist, da diese Technik immer große Datensätze erzeugt, die oft im Terabyte-Bereich.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. Kritische Schritte und Problemlösungen für die Datenerfassung
Die typischen Abbildungseinstellungen für ein GFP und RFP Probe exprimiert , kann das Lichtblatt statisch ist , durch eine zylindrische Linse gebildet in Tabelle 3. In dem beschriebenen Mikroskopaufbau gefunden werden. Die beiden Beleuchtungs Ziele sind Luft Linsen und das Detektionsobjektiv ist ein Wassertauchlinse. Zoom 1.0 mit 20x / 1,0 oder 40X / 1.0 Ziele gibt 230 nm und 115 nm Pixelgröße und ein Sichtfeld von 441 x 441 um oder 221 x 221 & mgr; m beziehungsweise. Es wird empfohlen, die Standard-Lichtbogendicke mit Zentrum zu nutzen Verhältnis zur Grenze 1: 2. Für 20X / 1.0 entspricht diese Dicke auf 4,5 & mgr; m und 40X / 1,0 bis 3,2 um in der Mitte. Wenn Abbildungsgeschwindigkeit nicht die primäre Priorität ist, verwenden separate Spuren im Fall einer Mehrfarbenmuster des Übersprechens der Fluoreszenzemission zwischen den Kanälen zu vermeiden. Die höchste Geschwindigkeit des Erwerbs wird durch die auf 50 ms pro z Schritt begrenztdie Geschwindigkeit der Bewegung des z-Treibers. Wenn das Ziel die maximale Abbildungsgeschwindigkeit bei, beispielsweise zu erreichen , ist, zwei Spuren mit doppelseitigen Beleuchtung muss die Belichtungszeit so eingestellt werden, dass die Summe aller aufgenommenen Bilder pro z Stufe unter 50 msec ist. Auf der anderen Seite, wenn nur ein einziges Bild pro z Schritt erfasst wird, ist es nicht von Vorteil, die Belichtungszeit kürzer als 50 msec eingestellt.
| 1920 x 1920 Bildgröße |
| 16-bit |
| Pivot-Scan auf |
| Doppelseitige Beleuchtung mit Hilfe eines Online-Fusion |
| 10X / 0.2 Beleuchtungsobjektiv |
| 20X / 1.0 W Plan-Apochromat Detektionsobjektiv |
| Track 1: Anregung 488 nm typischerweise 2% von 100 mW Laser, 550 nm SP Emissionsfilter |
| Track 2: Anregung 561 nm typischerweise 3% von 75 mW Laser, 585 nm LP Emissionsfilter |
| Die Belichtungszeit bis zu 100 ms |
| Z Stapeldicke von 50 bis 100 & mgr; m |
| 1-1,5 um z Schrittweite in der kontinuierlichen z Antriebsmodus |
| Inkubation bei 28,5 ° C |
Tabelle 3: Imaging – Einstellungen.
Inspizieren der Probe nach dem Versuch
Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Probe am Ende des Versuchs immer noch gesund ist. Als erste Anzeige, überprüfen Sie unter einem Stereoskop den Herzschlag der Probe. Mit einem Paar scharfe Zange kann die Probe der Agarose herausgenommen werden, und zog in den Inkubator zu entwickeln, um weiter zu prüfen, ob es durch die Abbildungs betroffen war. Alternativ kann es für die Antikörper-Färbung fixiert werden.
Montage und Drift
Es ist wichtig, die Osmolarität der Kammer s zu haltenÖSUNG nahe der Osmolarität des Einbettungs Agarose, sonst Schwellung / Schrumpfen der Agarose und nachfolgende Instabilität der Probe auftreten. Daher verwenden die gleiche Lösung (E3 Medium ohne Methylenblau), um die Kammer zu füllen und die 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Aliquots herzustellen. Darüber hinaus lassen Sie nicht die Agarose in der 70 ° C Heizblock für mehr als 2 Stunden, wie sie ihre Geliereigenschaften verlieren kann.
Nicht die Fische in zu heiß Agarose eingebettet werden, da dies zu Hitzeschockantwort oder den Tod des Embryos führen kann. Wenn Sie sich unsicher über die Wirkung von warmen Agarose auf den Embryonen zu überprüfen, dass der Schwanz nicht biegt und dass die Herzfrequenz nicht verlangsamt. Wenn dies der Fall ist, verwenden einen anderen Embryo für das Experiment.
Halten Sie die Gesamtlänge der Agarose-Säule mit der Probe kurz (ca. 2 cm) und montieren Sie den Zebrabärbling mit seinem Kopf orientiert sich an der Kolbenspitze. Ebenso extrudiert die Agarose Zylinder von der capillary sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Durch diese Maßnahmen wird die Stabilität der Probe während des Films gewährleisten. Zur gleichen Zeit muss die Agarose-Säule lang genug sein, so dass die Glaskapillare selbst nicht in den Lichtweg nicht erreicht, da diese große Brechung und Reflexion verursachen würde.
Die anfängliche Drift der Probe wird durch die Volumenänderungen des Agarose Zylinders selbst verursacht. Gleiten des Kolbens ist nicht der Grund dafür. Daher hilft es nicht, den Kolben mit Plastilin oder Nagellack zu fixieren. Der Embryo könnte seine Position während des Films ändern aufgrund seiner zu natürliches Wachstum. Dementsprechend ist es ratsam, die Region von Interesse in der Mitte des Sichtfeldes zu zentrieren und einen gewissen Spielraum an den Rändern halten, um diese Bewegungen aufzunehmen.
Reduzierte Menge Einbettungsmittel in dem Lichtweg
Die Probe Orientieren hilft richtig , die bestmögliche Bildqualität 15 zu erreichen. GenRallye, Anregungs- und Emissionslicht sollte so wenig Gewebe und Montage Medien wie möglich reisen. Die optimale Lösung ist Agarose freie Montage. Dies wurde beispielsweise in einer Einrichtung für Arabidopsis Seitenwurzelabbildungs 14 erreicht , in dem der Hauptwurzel in Phytagel montiert wurde und die Seitenwurzeln wurden anschließend ließ vollständig aus der Gelsäule wachsen. Agarose freie Montage wurde auch für die Abbildung des gesamten Embryonalentwicklung von Tribolium Käfer über zwei Tage 12 entwickelt. Verbesserung der Bildqualität war nicht eine primäre Motivation in diesem Fall. Tribolium Embryonen innerhalb der Agarose einfach nicht überleben lange genug. Ein absolut Einbettmedien freie Montage ist für langfristige Bildgebung in Zebrabärbling nicht erreicht worden. Dennoch können wir einen Vorteil aus der Tatsache, dass, wenn die Agarose erstarrt, werden die meisten Embryonen diagonal mit einem Auge in der Kapillare positioniert in der Agarose und des zweiten Auges sich tief auf die Oberfläche des Einbettungs Spalte die Nähe. Ter Auge näher an der Oberfläche liefert eine hervorragende Bildqualität und sollte daher bevorzugt abgebildet werden.
Agarose-Konzentration und Langzeitabbildungs
Die Konzentration der Agarose für die Montage ist ein Kompromiss zwischen Stabilität der Probe und die Möglichkeit, das Wachstum des Embryos und die Diffusion von Sauerstoff, um es aufzunehmen. Es ist keine zusätzliche Verstärkung in der Stabilität der Probe bei der Verwendung von Agarose-Konzentrationen von mehr als 1%. Als Ausgangspunkt für die Experimente zu optimieren, empfehlen wir 0,6% Agarose, die für Embryonen auch geeignet ist jünger als 24 HPF, die zu empfindlich sind in 1% Agarose montiert werden. Zu anästhesieren älteren Embryonen und Larven, kann die MS-222 – Konzentration ohne Nebenwirkungen 13-200 ug / ml erhöht werden.
Falls sich entwickelnden Embryonen länger als ± 12 hr abgebildet, Agarose Montage wird nicht empfohlen, weil es das Wachstum des Embryos und Caus schränktes Schwanz Verformung. Dieses Problem wurde gelöst , indem Zebrabärbling – Embryonen in FEP – Polymer Rohre mit einem Brechungsindex wie Wasser 13,39 Montage. Mausembryonen, andererseits kann an einer Spritze 41 angebracht in hohlen Agarose – Zylinder 40 oder in Löchern eines Acrylstab immobilisiert werden. FEP Rohrmontage ist allerdings nicht als Standardmethode empfohlen, da die Wand der Röhre bricht das Licht etwas mehr als Agarose.
Lichtbogenausrichtung
Für eine gute Bildqualität ist es wichtig, die automatische Lichtbogenausrichtung vor jedem Versuch durchzuführen. Insbesondere, wenn die Zoom-Einstellungen geändert wurden, wurden die Ziele herausgenommen, oder eine andere Flüssigkeit in der Kammer verwendet wird.
Erleuchtung
Die Pivot-Abtastung des Lichtblattes sollte immer aktiviert werden. Für große Streu Proben ist es erforderlich, das doppelseitige Beleuchtung mit Online f anzuwendenusion zu erreichen gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld. Doppelseitige Beleuchtungs verringert auch ein spezielles Problem des Auges Bildgebung, die durch die Linse des Embryos die Brechung des einfallenden Lichtbogen ist. Kleinere, weniger Streu Proben effizient werden kann unter Verwendung von einseitigen Beleuchtung abgebildet, der die Belichtungszeit um die Hälfte verkürzt und in etwas bessere Bildqualität im Vergleich zu doppelseitige Beleuchtung zur Folge haben kann. Dies ist, weil die Lichtwege für die beiden Beleuchtungsarme immer unterschiedlich sind und je effizienter eine ausgewählt werden kann. Zusätzlich sind die beiden Lichtbögen von jeder Seite kommen nie vollkommen in einer Ebene, die nach dem Fusions Verwischung mild verursacht. Für sehr schnelle intrazelluläre Ereignisse, wie die wachsenden Mikrotubuli (Movie 2), ist die doppelseitige Beleuchtung nicht geeignet, da die Bilder mit Beleuchtung von links und rechts der Reihe nach erfasst werden, die in der Bewegungsunschärfe führen könnte.
Photobleachingund Phototoxizität
Weniger Fluorophor Photobleaching wird oft als ein Hauptvorteil der LSFM erwähnt. Wir würden argumentieren, dass das Ziel überhaupt kein Photobleaching sein sollte. Wenn es in der Live-Imaging-Experiments bemerkbar Photobleaching ist, ist die Probe wahrscheinlich schon aus seiner physiologischen Bereich der tolerierten Laserbelichtung. Bei der Abbildung der Genaktivität in der Drehscheiben-Mikroskop, in unserer Erfahrung können hohe Phototoxizität Embryoentwicklung Stall deutlich, noch bevor die Fluoreszenzsignal bleicht. Daher sollten die Abbildungseinstellungen im LSFM eingestellt werden, so dass wenig oder kein Bleichen beobachtet wird. Obwohl LSFM auf die Probe sanft, ist es ratsam, nur soviel Laserleistung und Belichtungszeit zu verwenden, wie benötigt, um ein Signal-Rausch-Verhältnis ausreichend für die nachfolgende Datenanalyse zu erreichen.
Z-Stapel, Zeitintervalle und Datengröße
Die Dateien, die durch LSFM sind in der Regel sehr groß; manchmal im Terabyte-Bereich. Es ist oft notwendig, einen Kompromiß zwischen Bildqualität und Datengröße zu machen. Dies ist insbesondere der Fall für z Abstand von Stapeln und Intervalle in den Zeitraffer-Akquisitionen. Um die z Abständen die optimale Taste in der Z-Stapel Werkzeugregister definieren sollte idealerweise verwendet werden, insbesondere , wenn die Datenmenge wird später entfaltet werden. Sie berechnet den Abstand 50% Überlappung zwischen benachbarten optischen Scheiben zu erreichen. Dennoch sind etwas größer z Intervalle in der Regel akzeptabel. Sie reduzieren die Zeit benötigt, um die z-Stack sowie die endgültige Dateigröße zu erwerben. Die optimale Zeit Probenahme richtet sich nach dem Prozess von Interesse. Für die Gesamt Auge sind Entwicklung 5-10 min Intervalle in der Regel akzeptabel. Wenn einige Strukturen automatisch verfolgt werden, müssen die nachfolgenden Zeitpunkte ausreichend ähnlich sein.
fluoreszierende Kügelchen
Fluoreszierende Kügelchen dienen in erster Linie als Passermarken für die Registrierung von verschiedenen Ansichteneines Multi-View-Datensatz auf einander. Immer verwirbeln die Perle Lösungen vor Gebrauch gründlich. Erhitzen Sie nicht die Perlen, da dies zu einem Verlust des Fluoreszenzfarbstoffs führen kann. Die optimale Perlenkonzentration für die Multi-View-Registrierung muss experimentell ermittelt werden. Das beschriebene Plugin funktioniert am besten mit rund 1.000 erfassten Perlen während jeder Ansicht. Größere (500 nm oder 1000 nm) Perlen sind robuster als kleiner (weniger als 500 nm) Kügelchen detektiert. Dies liegt daran, größere Perlen sind heller und leichter zu Segment ohne Fehlalarmen von Strukturen in der Probe. Der Nachteil der größeren Kügelchen ist, dass sie in der endgültigen verschmolzenen und entfalteten Bild sehr prominent sind. Für jeden neuen Fluoreszenzmarker, die entsprechende Perlengröße und Fluoreszenzemission müssen optimiert werden. Um ein Beispiel für Probe aus Figur geben 5 und Movie 3, 100 nm grüne Emission Perlen gab zu viele falsche positive Erkennungen in der Membran-GFP – Kanal, aber 1000 nm rote Emission Perlen wurden in der H2B-RFP-Kanal mit sehr wenigen positiven Erkennungen innerhalb der Probe robust nachgewiesen. Wenn der Wulst Erkennung im Kanal mit dem Fluoreszenzmarker ausfällt, nur ein separater Kanal Kügelchen enthalten, können erhalten werden, aber dies ist nicht sehr praktisch. Die Unter Auflösung großen Perlen geben eine direkte Auslesen der Punktverteilungsfunktion (PSF) des Mikroskops, die für die Entfaltungs (2C-D) verwendet werden kann. Wenn die Registrierung und Fusion funktioniert besser mit größeren Perlen (zB 1000 nm), ein unterschiedliches Bild der PSF mit Unter Auflösung, beispielsweise 100 nm Perlen erworben werden. Mit mehrfarbigen Perlen ist hilfreich bei der Registrierung von mehrkanaligen Erfassung und zur Überprüfung, ob die Kanäle Overlay perfekt.
Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen ist nicht notwendig, wenn die Abbildung von einer einzigen Ansicht ohne nachfolgende Multiview-Registrierung und Fusion. Aber auch in diesen Fällen Kügelchen können während der Initia hilfreichl Lichtblatt Einstellung für die Qualität des Lichtblattes zu prüfen und im allgemeinen optischen Aberrationen zu offenbaren. Solche optischen Abbildungsfehler aus verschiedenen Quellen wie beschädigt oder verschmutzt Ziele, schmutzige Fenster der Kammer oder Inhomogenität in der Agarose stammen. Perlen kann auch für die Driftkorrektur durch die Multi – View – Registrierung Fidschi – Plugin 20 verwendet werden.
Multiview-
Für die Multi-View-Rekonstruktion Zweck ist es besser eine ungerade Anzahl von Ansichten 3, 5 und so weiter zu erwerben, die einander nicht gegenüberliegen. Dies verbessert Dekonvolution da die PSFs aus verschiedenen Richtungen abgebildet werden. Es ist auch wichtig zu Beginn des Zeitablauferfassung, um zu bestätigen, daß es unter den Ansichten ausreichende Überlappung ist. Dies wird am besten empirisch durchgeführt, das heißt, sofort bestätigt , dass die in dem ersten Zeitpunkt erfolgreich registriert werden. Wenn das Ziel der Multi-View-Akquisition ist die Auflösung zu erhöheneines Bildes eines großen Streu Probe, ist es nicht ratsam, Bild in jeder Ansicht die gesamte Probe, sondern um das Zentrum der Probe, in dem das Signal verschlechtert zu stoppen. Die niedrige Qualität Erwerb aus der zweiten Hälfte der Probe nicht nützliche Informationen für den Multi-View-Rekonstruktion hinzuzufügen.
2. Kritische Schritte und Fehlerbehebung für die Datenverarbeitung
Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten zur Verarbeitung von Multi-View-Daten von einem Lichtblatt-Mikroskop, die gut dokumentiert sind und relativ leicht zu übernehmen. Wir verwenden die Multi – View – Wiederaufbau – Anwendung, die eine Open – Source – Software in Fidschi 32 (Stephan Preibisch nicht veröffentlichten, implementiert ist Link – 1a und Link1b in der Liste der Materialien). Dieses Plugin ist ein wichtiges neues Design der früheren SPIM Registrierung Plugin 20, überprüftvon Schmied et al. 42, die BigDataViewer und seine XML und HDF5 Format 33 mit dem SPIM Registrierung Workflow (Abbildung 1B, die Integration von Link 2 , Link 3 ). Diese Anwendung kann auch für High Performance Computing Cluster angepasst werden, die sich der Verarbeitung 43 erheblich beschleunigt. Diese Multi-View-Registrierungsantrag wird weiter aktiv weiterentwickelt und wird immer besser. Im Falle von Problemen oder Funktionen Anforderungen für die beschriebene Software erfahren Sie Fragen zu den jeweiligen GitHub Seiten (Datei Link – 4 für Multiview- Wiederaufbau und Link – 5 für BigDataViewer).
Die zweite Option ist die kommerzielle Software erhältlich zusammen mit dem Mikroskop zu verwenden. Diese Lösung funktioniert gut und beschäftigt das gleiche Prinzip fluoreszierende Kügelchen der Verwendung der verschiedenen Ansichten zu registrieren. Allerdings fehlt es die Möglichkeit, den gesamten Datensatz schnell wie mit dem BigDataViewer zu visualisieren. Auch kann die Software nicht zum Cluster und darüber hinaus die Verarbeitungsblöcke das Mikroskop für andere Benutzer angepasst werden, es sei denn, zusätzliche Lizenz für die Software erworben wird.
Die dritte Option, die ist auch ein Open – Source – Software, wurde vor kurzem von der Keller – Labor 44 veröffentlicht und bietet einen umfassenden Rahmen für die Verarbeitung und Downstream – Analyse der Lichtblattdaten. Diese Software wird unter Verwendung von Informationen aus dem Inneren der Probe Multiview-Fusion durchzuführen, daher ist es nicht das Vorhandensein von fluoreszierenden Kügelchen erfordern um die Probe herum. Aber zur gleichen Zeit nimmt orthogonalen Ausrichtung der Abbildungsansichten (Ziele), so kann es nicht für Daten aus beliebigen Winkeln 44 erworben werden.
Hardware-Anforderungen
ntent "> Die Hardware für die Verarbeitung verwendet wird, kann in der Tabelle 4 entnommen werden. Es genügend Speicherkapazität und eine klare Pipeline für die Datenverarbeitung zur Verfügung, vor dem eigentlichen Experiment sein muss. Der Erwerb der Bilder ist schneller als die nachfolgende Analyse und es ist leicht , um mit nicht verarbeiteten Daten überflutet. Es ist oft unrealistisch 45 zu speichern alle rAW – Bilder, sondern eine beschnittene Version oder bearbeiteten Bilder wie fusionierten Ansichten, maximale Intensität Projektionen oder sphärische Projektionen.| Prozessor | Zwei Intel Xeon Prozessor E5-2630 (Six-Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s) |
| Erinnerung | 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC-RDIMM |
| Festplatte | 4 × 4 TB 3,5-Zoll-Serial-ATA (7.200 rpm) Festplatte |
| HDD-Controller | PERC H310 SATA / SAS-ConController für Dell Precision |
| HDD-Konfiguration | C1 SATA 3.5 Zoll, 1-4 Festplatten |
| Grafik | Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 Karten w / 2 DP & 1 DVI-I jeweils) (2 DP-DVI, 2 DVI-VGA-Adapter) (MRGA17H) |
| Netzwerk | Intel X520-T2 Dual-Port-10-GbE-Netzwerkkarte |
Tabelle 4: Hardware – Anforderungen.
Datenverarbeitungsgeschwindigkeit
Die Zeit für die Datenverarbeitung benötigt wird, hängt von den Dimensionen der Daten und von der verwendeten Hardware. In Tabelle 1 geben wir einen Überblick über die Zeit für die wichtigsten Schritte , die erforderlich bei der Verarbeitung ein Beispiel 8,6 GB Multi – View – Datenmenge , die mit 4 Ansichten und 2 Kanäle von 1 Zeitpunkt bestand.
| Die Verarbeitung sTEP | Zeit | Protokoll Schritt |
| Resave als HDF5 | 6 min 30 sec | 6.3 |
| Ermitteln Sie Interesse Points | 20 sec | 6.4 |
| Registrieren Sie Interesse Punkten | 3 Sek | 6.5 |
| Inhalt-basierte Multi-View-Fusion | 4 Stunden | 7.2 |
| Multiview- Entfaltungs (CPU) | 8 Stunden | 7.3 |
| Multiview- Entfaltungs (GPU) | 2 Stunden | 7.3 |
Tabelle 1: Datenverarbeitungszeit.
Eingangsdatenformate für Multi-View-Rekonstruktion
Die Fidschi – Plugin Multiview- Rekonstruktion kann .czi, .tif und ome.tiff Formate unterstützen. Aufgrund der Datenstruktur des .czi Format werden diskontinuierliche Datensätze nichtohne Vorverarbeitung unterstützt. Diskontinuierliche bedeutet , dass die Aufnahme neu gestartet werden musste (zB die Positionen neu zu justieren aufgrund der Probe zu treiben). In diesem Fall müssen die .czi Dateien neu gespeichert als .tif werden. Für TIF-Dateien jede Ansicht und Beleuchtungsrichtung muss als separate Datei gespeichert werden.
Kalibrierung der Pixelgröße
Das Mikroskop-Betriebssoftware berechnet die Kalibrierung für die Größe xy Pixels basierend auf dem ausgewählten Ziel. Jedoch ist die Pixelgröße in z unabhängig durch die Schrittgröße definiert. Wenn ein falsches Ziel in der Software der xy z-Verhältnis angegeben wird, ist falsch und die Registrierung fehl.
Erstzulassung
Die Datenmenge die Anzahl der Anmeldungen Nach der Definition wird 1 und die Anzahl der Punkte von Interesse sein wird , 0 im ViewSetup Explorer sein. Die anfängliche Registrierung stellt die Kalibrierung des Datensatzes. Sowohl die Zahl of Anmeldungen und Interesse Punkte werden während der Verarbeitung zu erhöhen.
Downsampling für bestimmte Punkte detektiert,
Verwendung Abwärtsabtastungs wird empfohlen, da das Laden der Dateien und die Segmentierung wird viel schneller. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Erfassungsparameter in Abhängigkeit von der Downsampling wird sich ändern, so dass Erkennungseinstellungen zwischen verschiedenen unten Beispieleinstellungen übertragen ist nicht möglich.
Bestimmte Punkte detektiert,
Es empfiehlt sich, Segment so viele echte Perlen wie möglich in jeder Ansicht, auch um den Preis von ein paar Fehlalarmen zu erhalten, weil sie nicht wesentlich die Registrierung behindern. Unechte Erkennungen, wenn nur wenige in Zahlen werden bei der Registrierung ausgeschlossen (Registrierung von Interesse Punkte Informationen). Allerdings massiven Fehlalarmen stellen ein Problem für den Algorithmus. Es reduziert nicht nur die Leistung für den Nachweis undDie Registrierung, da es viel länger Segment des Bildes sowie vergleichen diese Kügelchen zwischen den Ansichten erfolgt, sondern es verringert auch die Genauigkeit der Registrierung. Dies kann durch Verwendung strengerer Detektionsparameter adressiert werden. Zusätzlich über Segmentierung der Wülste (dh mehrere Erkennungen auf einer 1E bead) ist auf die Registrierung nachteilig und sollte vermieden werden.
Registrierung von Interesse Punkte
Um die Ansichten aufeinander, die Lage jeder Perle in jeder Ansicht registrieren zeichnet sich durch seine Position in Bezug auf die drei am nächsten benachbarten Perlen beschrieben. Diese Konstellationen bilden einen lokalen geometrischen Descriptor und ermöglichen Vergleichen jeder Wulst zwischen den Ansichten. Beads mit passendem Descriptor zwischen zwei Ansichten werden dann als Kandidat Korrespondenzen berücksichtigt. Beachten Sie, dass dies nur für Perlen statistisch verteilt arbeitet, für die die lokalen Deskriptoren für jedes Kügelchen typischerweise einzigartig sind.Man kann andere Strukturen verwenden wie Kerne in der Probe für die Registrierung. Um Kerne jedoch zu erkennen, die nicht zufällig in der Probe verteilt sind, gelten andere Methoden 20,21.
Die Kandidaten Korrespondenzen werden dann gegen RANSAC 36 getestet , um Fehlalarme auszuschließen. Jede Korrespondenz ist darauf hindeutet, ein Transformationsmodell für die Ansichten aufeinander überlagert. Wahre Korrespondenzen würde auf ein Transformationsmodell wahrscheinlich zustimmen, während Ausreißer würde jeder Punkt auf einer anderen. Die wahren Korrespondenzen werden dann eine affine Transformationsmodell zwischen den beiden verglichenen Ansichten zu berechnen verwendet. Eine globale Optimierung mit einem iterativen Optimierungsalgorithmus wird dann durchgeführt, bei dem alle Ansichten mit dem Ziel , eine minimale Verschiebung zwischen den Ansichten 20,21 auf den ersten Blick erfasst werden.
Zeitraffer-Registrierung
Wegen bewegenment der Agarose und unpräzise Motorbewegung des Mikroskoptisches, ändert sich die Position jedes Stapels mäßig über die Zeit. Während die Registrierung der einzelnen Zeitpunkt, um die Differenz zwischen den Ansichten von diesem Zeitpunkt entfernt, muss die Zeitraffer auch als Ganzes registriert sein. Zu diesem Zweck wird jede einzelne Zeitpunkt wird auf den Referenzzeitpunkt registriert.
Referenzzeitpunkt
Wenn eine Zeitreihe mit vielen Zeitpunkten verarbeitet wird, wird eine repräsentative Zeitpunkt als Referenz gewählt Regel von der Mitte der Zeitreihe, da die Sicke Intensitäten über die Zeit aufgrund von Bleich abbauen können. Auf dieser Referenz können die Parameter für Interesse Punkterfassung, Registrierung, Begrenzungsrahmen und Fusion bestimmt werden. Diese Parameter werden dann für die gesamte Zeitablauf aufgetragen, um eine spezifische Transformationsmodell für jeden einzelnen Zeitpunkt zu berechnen. Während Zeitraffer-Registrierung alle anderen Zeitpunkte sind auch per EinschreibenEred räumlich auf diesen Referenzzeitpunkt. Somit ist der Begrenzungsrahmen Parameter für die gesamte Aufnahme auf diesem bestimmten Zeitpunkt abhängig.
Mehrkanal-Registrierung
Wenn mehrere Kanäle Bildgebung, idealerweise die gleichen fluoreszierenden Kügelchen sollten in allen abgebildeten Kanäle sichtbar sein. Die Detektion und Registrierung kann dann für jeden Kanal einzeln durchgeführt werden, die den Einfluss der verschiedenen Lichtwellenlängen auf der Transformation berücksichtigt. Oft ist dies nicht möglich, da die Perlen in allen Kanälen nicht sichtbar sind oder die Kügelchen das Bild zu viel in einem Kanal dominieren und sind zu schwach in den anderen Kanal (n). Die typische Lösung ist sichtbar in einem Kanal nur für den Nachweis und die Registrierung und das erworbene Transformationsmodell Perlen zu verwenden (dh nach der Erfassung, Registrierung und Zeitraffer-Anmeldung) wird dann zu den anderen Kanälen von Fidschi angewendet> Plugins> Multiview- Reconstruction> Batch – Verarbeitung> Tools> Doppelte Transformationen. In dem Dropdown – Menü für die Transformation von Wählen Sie einen Kanal auf andere Kanäle übernehmen. Im folgenden Fenster wählen Sie die XML und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann den Kanal, der die Perlen als Quellkanal enthält und als Zielkanal wählen Sie den Kanal (n) ohne Perlen. Für doppelte denen verwenden Transformationen alle Transformationen und drücken Sie OK ersetzen. Die Transformationen werden dann auf alle anderen Kanäle kopiert und im XML – Format gespeichert. Um die neuen Transformationen im ViewSetup Explorer, starten Sie den Multiview Wiederaufbau Anwendung finden.
Markierungsrahmen
Die Fusion von mehreren Ansichten ist sehr rechenintensiv. Allerdings sind große Bilder typischerweise zur Aufnahme erworben, nicht nur die Probe, sondern auch die Perlen um ihn herum. Sobald die Registrierungsparameters aus den Perlen extrahiert werden, sind sie nicht mehr nützlich als Teil des Bildes. Daher ist die Effizienz der Fusion zu erhöhen, nur die Teile der Bildstapel der Probe enthalten, sollten miteinander verschmolzen werden. Ein Bereich von Interesse (Bounding Box) sollte die Probe zu enthalten und so wenig von der umgebenden Agarose wie möglich definiert werden. Für das Beispiel in Figur 2 eine gewichtete durchschnittliche Schmelz auf das gesamte Volumen mit 2229 × 2136 × 2106 Pixel würde 38.196 MB RAM erfordern, während mit einem Begrenzungskasten wird das Volumen auf 1634 × 1746 × 1632 Pixel , und die Speicheranforderungen reduziert werden reduziert zu 17.729 MB.
Inhalt-basierte Multi-View-Fusion
Die Herausforderung Multi-View-Daten in Fusion ist, dass die Ansichten in der Regel abrupt enden und enthalten nicht die gleiche Bildqualität für die gleichen Voxel. Einfache Mitteln der Ansichten daher Mischen Artefakte und unnötige Bildverschlechterung führen würde. Inhalt-basierte Multi-View-fu sion berücksichtigt diese beiden Probleme. Zunächst fügt es sich, die verschiedenen Ansichten, wo ein Bild endet und das andere beginnt und zweitens, beurteilt er die lokale Bildqualität und wendet höhere Gewichte auf eine höhere Bildqualität bei der Fusion 21. Im Vergleich zu einer einzigen Ansicht gibt es eine Verbesserung der Auflösung in z mit einer leichten Verschlechterung des Signals in xy (Abbildung 2E-H, 5A-D).
Multiview- Entfaltungs
Multiview- Entfaltungs ist ein weiterer Ansatz, um die Fusion der Ansichten zu erreichen. Mit dieser Methode auch die PSF der verschiedenen Ansichten berücksichtigt genommen, um das Bild zu gewinnen, die durch die Optik des Mikroskops convolved wurde. Dieses Verfahren verbessert drastisch die Bildqualität durch die Bildunschärfe zu entfernen und zunehmender Auflösung und den Kontrast des Signals 31 (2C-D, 2I-J, 5E-G, Movie 3).
ve_content "> Entfaltungs sehr rechenintensiv ist (siehe Tabelle 1), so dass eine GPU für die Verarbeitung unter Verwendung erhöht die Geschwindigkeit dieses Prozesses. Es ist auch notwendig sein, die Entfaltungs abwärts abgetasteten Daten durchzuführen. Um nach unten Beispiel verwenden Fidschi> Multiview- Wiederaufbau > Stapelverarbeitung> tools> anwenden Transformationen. wird dies eine neue Transformationsmodell auf Basis der Ansichten anwenden, die in der XML – Datei gespeichert werden.HDF5 Dateiformat für BigDataViewer und BigDataServer
Die BigDataViewer 33 ermöglicht eine einfache Visualisierung von Terabyte-Daten. Wie die BigDataViewer zu steuern , ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein Screencast von der grundlegenden Bedienung des Programms ist auch als Ergänzung in seiner ursprünglichen Veröffentlichung 33. Die BigDataViewer ist zentriert auf eine XML-Datei, die die Metadaten enthält, und eine hdf5 Datei, die die Bilddaten enthält. Die Bilddaten werden present im hdf5 in mehreren Auflösungsniveaus in 3D-Blöcke. Die mehreren Auflösungsstufen erlauben die Daten schneller und mit geringerer Auflösung zu visualisieren, bevor die volle Auflösung geladen ist. Einzelne Blöcke werden nur in den Speicher geladen. Somit ermöglicht das hdf5 Bildformat direkte und schnelle Visualisierung der Daten über die BigDataViewer 33. Es beschleunigt auch Verarbeitung, da das Laden der Dateien mehr aus effizient durchgeführt wird. Deshalb empfehlen wir, die Datenmenge in diesem Format resaving, obwohl es nicht unbedingt für die Verarbeitung erforderlich ist. Zur weiteren Erläuterung des Datenformats finden Sie auf Link 3 . Zusätzlich können die Datensätze mit Mitarbeitern oder der Öffentlichkeit geteilt werden , um die BigDataServer 33 (mit Link – 6 ).
| Schlüssel | <td> Wirkung|
| F1 | zeigt die Hilfe mit einer kurzen Beschreibung des BigDataViewer und deren Bedienung |
| <> Oder Mausrad | Bewegung in z |
| Auf- und Abwärtspfeil | vergrößern und verkleinern |
| rechts klicken und ziehen | bewegt Probe im Viewer |
| links klicken und ziehen | dreht Probe um den Cursor |
| Regler am unteren Rand des Betrachters oder Tab und links oder rechts Pfeil | bewegt sich auf der Zeitachse |
| zusätzlich shift | schneller Bewegung oder Drehung entlang einer Achse |
| x und dann links und rechts Pfeil | dreht sich um die x-Achse |
| y und dann links und rechts Pfeil | dreht sich um die y-Achse |
| z und dann links und rechts Pfeil | dreht sich um die z-Achse |
| Verschiebung und x | richtet die Ansicht entlang der x-Achse |
| Verschiebung und y | richtet die Ansicht entlang der y-Achse |
| Verschiebung und z | richtet die Ansicht entlang der z-Achse |
| ich | Umschaltung zwischen den verschiedenen Interpolationsmodi (dh nächste Nachbar und trilinear) |
| s oder Einstellungen> Helligkeit und Kontrast | ändert die Farbe der Kanäle, Helligkeit und Kontrast |
| F6 oder Einstellungen> Sichtbarkeit und Gruppierung | ändert die angezeigten Gruppen ermöglicht Gruppierung zu verschiedenen Gruppen überlagern und die Gruppen über die Zifferntasten aufrufen |
| F10 oder Werkzeuge> Film aufnehmen | erwirbt eine Zeitreihe des aktuell angezeigten Scheibe |
Tabelle 2: Big Data Viewer.
3. Einschränkungen der beschriebenen Umsetzung von LSFM
Low-Durchsatz
In einem typischen LSFM Experiment nur eine Probe pro Experiment abgebildet wird. Dennoch gibt es in unserer Erfahrung können viele nützliche Informationen aus diesem einzigen Probe extrahiert werden. Hochdurchsatz – Abbildungs mehrerer Embryonen wurde in Haus gebaut LSFM Aufbauten 46-48, obwohl in der Regel auf Kosten der Freiheit der Probenpositionierung und Rotation kürzlich erreicht.
Unzureichende Penetration tief in das Gewebe
Obwohl Zebrabärbling Embryonen durchscheinend sind, ist die erhaltene Bildqualität schnell verschlechtert wird, wenn in dem Gewebe tiefer Abbilden aufgrund von Streuung und Absorption. Teilweise ist dies ein Effekt der Streuung und Absorption der emittierten Fluoreszenz von der Probe und nicht in der aktuellen Einstellungen korrigiert werden kann. Eine weitere Quelle für die ungleichmäßige Bildqualität ist die unregelmäßige Beleuchtung. Ter Lichtbogen fällt von der linken oder rechten Seite und alle Objekte auf seinem Weg brechen es, die in Streifen Artefakte und Unschärfe führt. Die doppelseitige Beleuchtung und Multi-View-Fusion, die Artefakte im endgültigen Bild verringern kann. Schließlich neigt die Bildqualität etwas schlechter gegenüber dem Rand des Sichtfeldes auf die natürliche Geometrie des Lichtbogen aufgrund sein, die dicker zu den Rändern gewinnt.
Begrenzte chemische Manipulation
Der Gebrauch von Drogen oder Inhibitoren ist weit verbreitet in Zebrabärbling Forschung. In diesem Mikroskop Gebrauch von Drogen gezwungen ist, aufgrund des großen Volumens der Probenkammer und Erwägungen anderer Nutzer des Instruments, die die gleiche Kammer teilen. eine zusätzliche Kammer Droge Experimente gewidmet Verwendung kann dieses Problem lösen. die Kammer teilweise mit Glasperlen Füllung verringert das Flüssigkeitsvolumen, das erforderlich ist.
Kein Photomanipulation
Currently gibt es keine Möglichkeit, lokalisierte optische Manipulation wie Photo oder Laserablation in diesem Mikroskop. Trotzdem kann Haus gebaut Setups für solche speziellen Anwendungen verwendet werden.
4. Bedeutung und zukünftige Anwendungen
LSFM ist die beste Methode zur schnellen Abbildung von großen Mengen an lebenden Embryonen auf dem Laufenden. Die meisten Versuche denkbar auf einem konfokalen Mikroskop kann auch auf einem Lichtbogen-Mikroskop mit oben genannten Vorteilen durchgeführt werden. Im Fall der Abbildung von der Entwicklung des Auges, ist die Geschwindigkeit der LSFM nicht der entscheidende Parameter. Stattdessen sind die geringe Phototoxizität und Flexibilität bei der Positionierung der Probe die entscheidenden Vorteile.
Die LSFM Daten haben einen hohen SNR, die eine gute Entfaltungs Ergebnisse zu erzielen hilft und ist auch für die automatisierte Bildanalyse und Objektverfolgung von Vorteil. Abschließend ist LSFM ein großes Werkzeug zur Erzeugung von quantifizierbare Daten auf die embryonale Entwicklung und Marktpreisefürll Zell- und Gewebeeigenschaften für nachfolgende Modellierung und physikalische Beschreibungen der Prozesse in Frage.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
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