Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling
Summary
Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af organudvikling i zebrafisk embryoer ved hjælp af en fluorescens dissektionsmikroskop der kan udføre optisk sektionering og enkle strategier for omstilling til at korrigere fokal og plane afdrift.
Abstract
For at forstå organogenese, de rumlige og tidsmæssige ændringer, der opstår under udviklingen af væv skal registreres. Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af normal og nedsat nyre udvikling i zebrafisk embryoer ved hjælp af en fluorescens dissektionsmikroskop udstyret til struktureret belysning og erhvervelse z-stak. For at visualisere nephrogenesis, transgene zebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescens-mærkede nyre strukturer blev anvendt. Nyrer fejl blev udløst af injektion af en antisense morpholino oligonukleotid mod Wilms tumor genet wt1a, en faktor, der vides at være afgørende for nyre udvikling.
Fordelen ved forsøgsopstillingen er kombinationen af en zoom mikroskop med simple strategier for omfordeling af justering bevægelser i x, y eller z-retningen uden yderligere udstyr. For at omgå omdrejningspunkt afdrift, der er fremkaldt af temperatursvingninger og mekaniske vibrationer, En autofokus strategi blev anvendt i stedet for anvendelse af en normalt kræves klimakammer. For at re-justere positionelle ændringer som følge af en xy-drift, blev billeddannelse kamre med påtrykt udflytning gitre ansat.
I forhold til mere komplekse opsætninger for tidsforskudt optagelse med optisk sektionering såsom konfokal laserscanning eller lys ark mikroskoper, en zoom-mikroskop er let at håndtere. Desuden tilbyder det dissektionsmikroskop-specifikke fordele, såsom høj dybdeskarphed og en udvidet arbejdsafstand.
Fremgangsmåden til at studere organogenese præsenteres her kan også anvendes med fluorescens stereo mikroskoper ikke i stand til optisk sektionering. Selvom begrænset til high-throughput, denne teknik tilbyder et alternativ til mere komplekse udstyr, der normalt bruges til tidsforskudt optagelse af udviklingslandene væv og organsystemer dynamik.
Introduction
Efter gastrulation, organogenesen er den næste fase af en persons levetid. Det involverer omlejringen, interaktion og meget ofte migration af celler til at producere væv og organer. Usikkerhed i de processer der ligger til grund for udviklingen af organer fører ofte til sygdomme, der kan manifestere sig enten med det samme eller også senere i livet. Således at forstå organogenesen har været en stor indsats i udviklingsmæssige biologi og biomedicinsk forskning. For at kunne undersøge udviklingen af et bestemt organ, det skal være synlig, selv gennem kroppen væg af embryoet. Dette muliggør optagelsen af de rumlige og tidsmæssige ændringer, der opstår under udvikling. Også for at analysere betydningen af faktorer involveret i organogenese, skal det være modtagelige for manipulation.
En organisme, der er overordentlig velegnet til undersøgelse af in vivo organogenese er zebrafisk. Dens gennetighed under fosterudviklingen i kombination med anvendelse af fluorescerende transgene linier tillader observation af protein lokaliserings- og udtryk dynamik, samt visualisering af de indre organer 1. Dette giver en unik fordel vedrørende undersøgelsen af organudvikling i realtid i forhold til pattedyr modeller, hvis organer er utilgængelige for mikroskopisk analyse. Desuden er forskellige værktøjer til rådighed til at manipulere fosterudviklingen af zebrafisk. Udover generering af mutante linjer, kan antisense morpholino oligonukleotider (MO) anvendes til knockdown aktiviteten af bestemte gener, som er involveret i udviklingen af visse organer. MOS enten målrette en splejsningssted eller den translationelle startkodon (AUG), og derved interferere med splejsning af præ-mRNA eller translation.
Zebrafisk embryoniske nyre, de pronephros, er en anatomisk simpelt, men værdifuldt model til at studere nyre udvikling og funktion af genes forbindelse med nyresygdomme 2. Den består af kun to funktionelle enheder kaldet nefroner. Hver nephron består af en glomerulus, hvor blod filtrering finder sted 3. Andre komponenter er den korte hals regionen samt den segmenterede tubulus for sekretion og reabsorption af opløste stoffer og kanalen, der ender i kloakken 4. Uanset dens enkle sammensætning, organisation og de forskellige celletyper af zebrafisk pronephros er meget lig den mammale nyre 5,6.
En faktor, der er kritisk involveret i nyre udvikling, kodes af Wilms tumorsuppressorgen WT1 7. Zebrafisk besidder to paraloger kaldet wt1a og wt1b udtrykkes i en overlappende, men ikke identiske mønstre under udviklingen af pronephros 8. Ved at anvende transgene zebrafisk med GFP-mærkede pronephros strukturer, er det blevet vist, at fuldstændig knock-down af wt1a </ em> eller af en splejset form fører til svære og milde misdannelser af embryoniske nyre, henholdsvis 9,10.
Den her beskrevne metode tillader time-lapse-analyse af normal og nedsat nephrogenesis i zebrafisk embryoner ved at ansætte en fluorescens dissektionsmikroskop udstyret til optisk sektionering via struktureret belysning. Optiske sektioner generelt tilladelse til erhvervelse af billeder, som kun indeholder i fokus oplysninger. Out-of-fokus oplysninger kan undgås ved forskellige tilgange såsom matematiske algoritmer (f.eks. Udfoldning), optisk design (f.eks konfokal laser scanning mikroskopi) eller en kombination af begge (f.eks struktureret belysning).
For at inducere defekter i nyre udvikling anvendte vi en antisense MO mod wt1a der blev injiceret i en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denne linje viser GFP-fluorescens i glomerulus, hals og den forrestedel af tubulus 9,10. I forhold til mere komplekse opsætninger til tidsforskudte optagelser med optisk sektionering såsom laserscanning eller lys ark mikroskoper, en zoom-mikroskop er let at håndtere og billigere. Desuden kan udstyr til struktureret belysning nemt kombineres med konventionelt fluorescens udstyr (f.eks fluorescens lampe, filtre) og tilbyder dissektionsmikroskop-specifikke fordele, såsom en længere arbejdsafstand og stort synsfelt. Problemer med afdrift blev løst uden brug af ekstra udstyr (klimakammer, anti-vibration tabel) normalt kræves for stabile resultater. For at korrigere for fokal drift en autofokus strategi blev etableret og billedbehandling kamre med præget flytning gitre blev udnyttet til at re-justere placeringen efter et skred i x eller y retning.
I denne procedure kan også anvendes til mikroskoper uden optiske sektionsopdelingen muligheder, såsom fluorescens stereo microscopes og tilbyder et alternativ til mere komplekse udstyr, der normalt bruges til tidsforskudt optagelse af udviklingslandene væv og orgel dynamik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisken er blevet en populær model organisme til studier af hvirveldyr udvikling og modellering af sygdomme hos mennesker. Fordi zebrafisk embryoner forbliver transparente, kan udvikle organer som hjerne og hjerte observeres ved anvendelse af en standard præparat mikroskop. Drage fordel af transgene linjer med orgel specifik fluorescens giver vurderinger af organogenese hele forskellige udviklingsstadier i levende embryoner ved fluorescens mikroskopi. En begrænsning til billeddannelse strukturelle detaljer i hele organer med standard epifluorescens mikroskopi er virkningen af signaler fra objekter over og under fokusplanet. Denne ude-af-fokus lys ikke kun resulterer i nedsat billede kontrast og opløsning, det også kan skjule vigtige strukturer af interesse 13,14. Adskillige teknikker såsom laserscanning confocal-, spinning disk confocal- eller multifoton mikroskopi er blevet udviklet til at minimere ude af fokus information og dermed i stigendee billedets kontrast samt aksial opløsning. En alternativ metode til at opnå optiske sektioner er laser- og scanning fri struktureret belysning mikroskopi, et bredt felt baseret belysning teknik, der er og enkel at gennemføre på en regelmæssig mikroskop 15. Resultaterne præsenteres her illustrerer, at optisk sektionering, opnås ved struktureret belysning, gennemføres på et dissektionsmikroskop og kombineret med rekonstruktion af udvidede fokus billeder, muliggør visualisering af strukturelle detaljer i normal og forstyrret nyre udvikling i zebrafisk. Især er de GFP-positive celler i wt1a morphants dispergeret ved forskellige fokale dybder, og billeder af kun et plan med fokus sløre out-of-undervurdering af den tredimensionelle kompleksitet fænotype.
For at følge dynamikken i orgel organisation, omlejring eller forstyrrelser, tidsforskudt fluorescensmikroskopi er en kraftfuld omend kompleks teknik. Under time-lapsebilledbehandling små vibrationer eller temperatursvingninger mindre forårsager driver i x, y eller z retning. Dette kræver ekstra udstyr (klimakammer, anti-vibration tabel) for at opnå stabile resultater. Den præsenterede metode bruger evne et dissektionsmikroskop med en motoriseret fokus drev til optagelse time-lapse billeder uden ekstra enheder. For at opretholde en stabil fokus, blev en autofokus strategi etableret og en flytning gitter præget ind i bunden af afbildningskammeret blev anvendt til korrektion af x, y-ustabilitet.
Korrekt indlejring af embryo er et afgørende skridt i protokollen. Der er behov for nogle praksis at placere strukturen af interesse så tæt som muligt på glasbund og i tæt nærhed til nettet uden overlejring med det.
Den største fordel ved metoden er, at det er en overkommelig og simpelt værktøj til direkte observation af udviklingsmæssige processer såsom vækst og migration i levendeembryoner over flere timer. Desuden dissektion mikroskop-specifikke fordele såsom stort synsfelt og udvidet arbejdsafstand lette undersøgelse af større prøver, herunder hele organer. har dog nogle begrænsninger, der skal holdes for øje. Pause af eksperimentet for at kontrollere og justere positioneringen gør proceduren tidskrævende og fraværet af en robust styring temperaturændringer "standard" udviklingsmæssige tidspunkt, der er defineret som timer efter befrugtning ved 28,5 ° C i zebrafisk 16. Et andet potentielt problem er den begrænsede dybde af billeddannelse i dyr, især når strukturen af interesse er placeret inde i embryoner eller larver. En sådan struktur er den zebrafisk pronephric glomerulus, som ligger mellem de somitter og blommesækken. Den begrænsende dybde til afbildning glomerulus viste sig at være omkring 200 um, en afstand, der nås efter 5 dages udvikling. Derimod fluorescerende strukturer, der er located tættere på overfladen af dyret kan afbildes i længere tid. For eksempel leverceller er tilgængelige for billedbehandling i hvert fald indtil 9 dpf. En yderligere begrænsning er, at langsigtet immobilisering af embryo eller larver i agarose og tricaine behandling fremkalde vækst retardering og hjerte-ødem, hhv. Da dette kan forstyrre normal udvikling, anbefales det at begrænse varigheden af tidsforskudt optagelse til en bestemt periode af interesse. At sikre, at der under billeddannelse strukturer af interesse udvikle sig normalt er det nyttigt at sammenligne (i slutningen) det generelle udseende med den af et dyr holdes under samme forsøgsbetingelser men uden indlejring og bedøvelse.
Optagelse af en z-stak af optiske sektioner hver 30 minutter over en periode på 5 timer og efterfølgende beregning af udvidet dybdeskarphed billeder leveres rumlige og tidsmæssige oplysninger om tidlige begivenheder i normal og forstyrret nyre udvikling, der blev induceret by morpholino-medieret knockdown af wt1a. Tidligere udførte morpholino knockdown forsøg har allerede vist, at Wt1a opfylder en tidlig og væsentlig rolle i pronephros dannelse In situ hybridisering med nyre markør 17,18 og beskæftigelse af transgene wt1b:. GFP linje for billeddannende pronephros udvikling på fast tidspunkt peger 9,10 afsløret at wt1a mangel resulterer i forstyrret glomerulær morfogenese og mislykkedes podocyte specifikation. I modsætning til disse statiske tilgange, tidsforskudte optagelser direkte visualisere dynamikken i tidlig nephrogenesis i kontrolrum embryoner og migration af GFP-positive celler fra pronephric region wt1a morphants. Muligheden for at spore misrouted celler over tid giver en mere detaljeret fænotype-analyse.
Generelt er fremgangsmåden, der er præsenteret her tilvejebringer en billig og nem at bruge alternativ til komplekset, og mindre tilgængelig SEtups normalt anvendes til time-lapse billeddannelse såsom laser scanning mikroskop (udstyret med en miljømæssig kammer og anti-vibration tabel) eller lys ark mikroskop. Den beskrevne rutine til at fastsætte afdrift problemer kan også anvendes til at udføre time-lapse billeder på opsætninger uden optiske sektionsopdelingen muligheder, såsom fluorescens stereo mikroskoper.
Teknikken er ikke kun egnet til at undersøge nyre udvikling, men kan også anvendes for at følge normale og defekte morfogenese af andre organer, såsom hjerte og lever. Endvidere kan fremgangsmåden anvendes til at observere forskellige mere dynamiske processer i embryonal og voksen modelorganismer såsom sårheling eller regenerering.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Thomas Bates for kritisk læsning og forbedre manuskriptet. Vi takker også Christina Ebert og Sabrina Stötzer for fisk vedligeholdelse.
Materials
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
| 0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
Referências
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O’Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
