Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie
Summary
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.
Abstract
Om organogenese begrijpen, de ruimtelijke en temporele veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van weefsels moeten worden opgenomen. De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van normale en gestoorde nierontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden uitgerust voor gestructureerde verlichting en z-stack acquisitie. Te visualiseren nefrogenese, transgene zebravis (Tg (wt1b: GFP)) met fluorescent gelabelde nier structuren werden gebruikt. Renale gebreken werden veroorzaakt door injectie van een antisense oligonucleotide morfolino tegen de Wilms tumor gen wt1a, een factor bekend is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de nieren te zijn.
Het voordeel van de experimentele opstelling is de combinatie van een zoom microscoop met eenvoudige strategieën voor hergebruik verstelbewegingen in x, y of z-richting zonder extra apparatuur. Om focale drift die wordt veroorzaakt door temperatuurschommelingen en mechanische trillingen te omzeilenEen autofocus strategie werd toegepast in plaats van het gebruik van een gewoonlijk vereist klimaatkamer. Om opnieuw aan te passen aan de positionele veranderingen als gevolg van een xy-drift, imaging kamers met ingedrukt verhuizing roosters werden gebruikt.
In vergelijking met de meer complexe instellingen voor time-lapse-opname met optische sectie zoals confocale laser scanning of lichte blad microscopen, een zoom-microscoop is gemakkelijk te hanteren. Bovendien biedt deze ontleden microscoop-specifieke voordelen zoals een hoge scherptediepte en een langere werkafstand.
De werkwijze in organogenese hier gepresenteerde onderzoek kan ook worden gebruikt met fluorescentie stereomicroscoop niet kunnen optische sectie. Hoewel beperkt voor high-throughput, deze techniek biedt een alternatief voor de meer complexe apparatuur die normaal gesproken wordt gebruikt voor de time-lapse-opname van het ontwikkelen van weefsels en organen dynamiek.
Introduction
Naar aanleiding van de gastrulatie, organogenese is de volgende fase van de levenscyclus van een individu. Het gaat om de omlegging, interactie en vaak migratie van cellen naar weefsels en organen veroorzaken. Onjuistheid in de processen die de ontwikkeling van organen leidt vaak tot ziekten die zich direct of ook later manifesteren in het leven. Zo, het begrijpen van de organogenese heeft een grote inspanning in de ontwikkelingsbiologie en biomedisch onderzoek. Om te kunnen de ontwikkeling van een bepaald orgaan te onderzoeken, moet toegankelijk zijn zelfs door de lichaamswand van het embryo. Dit maakt de registratie van de ruimtelijke en temporele veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling. Ook om het belang van factoren betrokken bij organogenese analyseren, moet kunnen worden gemanipuleerd is.
Een organisme dat is uitermate geschikt voor het onderzoek in vivo organogenese zebravis is. zijn tranrantie tijdens de embryonale ontwikkeling in combinatie met het gebruik van fluorescente transgene lijnen maakt waarneming van eiwit lokalisatie en expressie dynamiek en de visualisatie van de inwendige organen 1. Dit levert een uniek voordeel betreffende het onderzoek van orgaanontwikkeling realtime opzichte van zoogdierlijke modellen waarvan organen toegankelijk voor microscopische analyse. Bovendien zijn verschillende gereedschappen zijn beschikbaar om de embryonale ontwikkeling van de zebravis te manipuleren. Naast het genereren van mutante lijnen, kunnen antisense morfolino- oligonucleotiden (MO) worden gebruikt om de activiteit van bepaalde genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organen knockdown. MO targeten een splitsingsplaats of translationele startcodon (augustus), en interfereren met splitsing van pre-mRNA of translatie.
De zebravis embryonale nier, de pronephros, een anatomisch eenvoudig maar nuttig model voor nier ontwikkeling en functie van gen bestuderenes verband met nierziekten 2. Het bestaat uit twee functionele eenheden genaamd nefronen. Elk nefron bestaat uit een glomerulus waar het bloed filtratie plaatsvindt 3. Verdere onderdelen zijn de korte nek en de gesegmenteerde tubuli voor secretie en reabsorptie van opgeloste stoffen en de leiding, die eindigt in de cloaca 4. Ongeacht de eenvoudige samenstelling, de organisatie en de verschillende celtypen van de zebravis pronephros lijken sterk op het zoogdier nier 5,6.
Een factor, die een cruciale rol speelt in nierontwikkeling wordt gecodeerd door het Wilms-tumorsuppressorgen WT1 7. Zebravis bezitten twee paralogen genoemd wt1a pt wt1b in een overlappende, maar niet identiek patroon wordt uitgedrukt tijdens de ontwikkeling van de pronephros 8. Door het gebruik van transgene zebravis met GFP-gelabelde pronephros structuren, is aangetoond dat volledige omverwerpen van wt1a </ em> of van een bepaalde splice vorm leidt tot ernstige of milde misvormingen van de embryonale nier, respectievelijk 9,10.
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van normale en verminderde nefrogenese in zebravis embryo door toepassing van een fluorescentie microscoop ontleden ingericht voor optische sectie via gestructureerde verlichting. Optische secties in het algemeen kan de beeldopname die op scherpgestelde gegevens bevatten. Out-of-focus informatie kan worden voorkomen door verschillende benaderingen als wiskundige algoritmen (bijv. Deconvolutie), optisch ontwerp (bijv confocale laser scanning microscopie) of een combinatie van beide (bijv gestructureerde verlichting).
Defecten in de ontwikkeling van de nieren veroorzaken we gebruik gemaakt van een antisense MO tegen wt1a dat werd geïnjecteerd in een transgene zebravis lijn (Tg (wt1b: GFP)). Deze lijn toont GFP-fluorescentie in de glomerulus, de hals en de voorsteeen deel van de tubulus 9,10. In vergelijking met complexere opstellingen voor time-lapse opnamen met optische sectie zoals laser scanning of lichtwaaier microscopen, een zoom microscoop is gemakkelijk te hanteren en goedkoper. Bovendien, uitrusting voor gestructureerde verlichting kan eenvoudig worden gecombineerd met conventionele fluorescentie-apparatuur (bijvoorbeeld fluorescentie lamp, filters) en biedt ontleden microscoop-specifieke voordelen, zoals een langere werkafstand en groot gezichtsveld. Problemen met drift werden opgelost zonder het gebruik van extra apparatuur (klimaatkamer, anti-vibratie tabel) meestal nodig voor stabiele resultaten. Om te corrigeren voor focal drift een autofocus strategie werd opgericht en imaging kamers met opdruk verhuizing roosters werden gebruikt om opnieuw aan te passen aan de positionering na een drift in de X- of Y-richting.
De onderhavige methode kan ook worden toegepast op microscopen zonder optische sectie opties, zoals fluorescentie stereo microscopes en biedt een alternatief voor de meer complexe apparatuur die normaal gesproken wordt gebruikt voor de time-lapse-opname van het ontwikkelen van weefsels en organen dynamiek.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zebravis is een populaire modelorganisme voor studies van ontwikkeling van vertebraten en modellering van menselijke ziekten. Omdat de zebravis embryo's transparant blijven, kan de ontwikkeling van organen zoals de hersenen en het hart worden waargenomen door het gebruik van een standaard voorbereiding microscoop. Maken van transgene lijnen met orgaanspecifieke fluorescentie maakt evaluaties van organogenese over verschillende ontwikkelingsstadia in levende embryo's door fluorescentiemicroscopie. Een beperking voor het afbeelden structurele details van hele organen met conventionele epifluorescentie microscopie wordt de invloed van de signalen van voorwerpen boven en onder het brandpuntsvlak. Deze out-of-focus licht resulteert niet alleen in een vermindering van het contrast en de resolutie, het kan ook belangrijke structuren van belang 13,14 verduisteren. Verschillende technieken zoals laser scanning confocal-, draaiende schijf confocal- of multifoton microscopie zijn ontwikkeld om de out-of-focus informatie en daardoor increas minimaliserene beeldcontrast evenals axiale resolutie. Een alternatieve methode voor optische verkrijg de laser- en scannen vrije gestructureerde verlichting microscopie, een breed verlichtingsbesturing techniek die is en eenvoudig te implementeren op een gewone microscoop 15. De hier gepresenteerde resultaten illustreren dat optische sectie, gerealiseerd door gestructureerde verlichting, uitgevoerd op een dissectie microscoop en gecombineerd met de wederopbouw van de uitgebreide aandacht beelden, maakt visualisatie van structurele details van de normale en verstoorde ontwikkeling van de nieren in de zebravis. In het bijzonder worden de GFP-positieve cellen in wt1a morfants gedispergeerd op verschillende focale diepte, en afbeeldingen van slechts één vlak met uit onscherpe blur zou de driedimensionale complexiteit van het fenotype onderschatten.
Om de dynamiek van orgel organisatie, omlegging of verstoring te volgen, time-lapse fluorescentie microscopie is een krachtige, zij complexe techniek. Tijdens de time-lapseimaging lichte trillingen of kleine temperatuurschommelingen leiden tot afwijkingen in x, y of z-richting. Dit vereist extra apparatuur (omgevingskamer, antivibratietafel) om stabiele resultaten te verkrijgen. De gepresenteerde methode maakt gebruik van de mogelijkheid van een dissectie microscoop met een gemotoriseerde nadruk schijf voor time-lapse opnemen van beelden zonder extra apparatuur. Om een stabiele scherpstelling behouden, werd een autofocus strategie vastgesteld en een verplaatsing raster afgedrukt in de bodem van de beeldvorming kamer werd gebruikt voor correctie van x, y instabiliteit.
Een goede inbedding van het embryo is een cruciale stap in het protocol. Even oefenen is nodig om de structuur van belang zo dicht mogelijk bij de glazen bodem en in dichte nabijheid tot het netwerk plaatsen zonder ermee bedekken.
Het belangrijkste voordeel van de werkwijze is dat het een betaalbare en eenvoudig hulpmiddel voor directe waarneming van ontwikkelingsprocessen zoals groei en migratie in levendeembryo's gedurende een aantal uren. Bovendien is de dissectie microscoop specifieke voordelen zoals grote beeldveld en lange werkafstand vergemakkelijken onderzoek van grotere monsters waaronder hele organen. Echter, een aantal beperkingen in gedachten worden gehouden. Pauzeren van het experiment te controleren en stel de positionering maakt de procedure tijdrovend en het ontbreken van een solide regeltemperatuur verandert de "standaard" ontwikkelingstijd, gedefinieerd als h na bevruchting bij 28,5 ° C gedurende 16 zebravis. Een ander potentieel probleem is de beperkte diepte van de beeldvorming in het dier, met name wanneer de structuur van belang zich in het embryo of larven. Een dergelijke structuur is de zebravis pronephric glomerulus, gelegen tussen de somieten en de dooierzak. De beperkende diepte voor het afbeelden van de glomerulus bleek ongeveer 200 urn, een afstand die wordt bereikt na 5 dagen van ontwikkeling. Daarentegen fluorescerende structuren die located dichter bij het oppervlak van het dier kan worden afgebeeld langer. Bijvoorbeeld levercellen toegankelijk zijn voor de beeldvorming ten minste tot 9 DPF. Een andere beperking is dat langdurige immobilisatie van het embryo of larven in agarose en behandeling tricaïne induceren groeivertraging en cardiale oedeem, respectievelijk. Omdat dit kan interfereren met de normale ontwikkeling, is het raadzaam om de duur van de time-lapse-opname te beperken tot een bepaalde periode van belang. Om ervoor te zorgen dat tijdens de beeldvorming structuren van belang te ontwikkelen normaal gesproken is het nuttig om te vergelijken (aan het eind) de totale uitstraling met die van een dier gehouden onder dezelfde experimentele omstandigheden, maar zonder inbedding en verdoving.
Het opnemen van een z-stapel optische secties elke 30 minuten gedurende 5 uur en vervolgens berekenen van uitgebreide scherptediepte beelden ontvangen ruimtelijke en temporele informaties vroege gebeurtenissen van normale en nierstoornissen ontwikkeling die werd geïnduceerd by morfolino-gemedieerde knockdown van wt1a. Eerder uitgevoerde morfolino knockdown experimenten hebben al aangetoond dat Wt1a vervult een vroege en essentiële rol in de vorming van pronephros In situ hybridisatie met nier marker 17,18 en de werkgelegenheid van de transgene wt1b:. GFP lijn voor de ontwikkeling van imaging pronephros op vaste tijdstippen 9,10 onthuld dat wt1a deficiëntie resulteert in verstoorde glomerulaire morfogenese en mislukte podocyte specificatie. In tegenstelling tot deze statische benadering, time-lapse-opnamen direct dynamiek van vroege nefrogenese controle embryo's en de migratie van GFP-positieve cellen weg van de pronephric regio wt1a morphants visualiseren. De mogelijkheid om ze verkeerd verzonden cellen te volgen in de tijd maakt een meer gedetailleerde analyse fenotype.
In het algemeen is de methode die hier wordt voorgesteld verschaft een goedkoop en gemakkelijk te gebruiken alternatief voor de complexe en minder toegankelijk setups normaal gebruikt voor time-lapse imaging zoals laser scanning microscoop (uitgerust met een klimaatkamer en anti-vibratie tabel) of lichte plaat microscoop. De beschreven routine om drift problemen op te lossen kan ook worden toegepast op time-lapse beelden op setups uit te voeren zonder optische sectie opties, zoals fluorescentie stereo microscopen.
De techniek is niet alleen geschikt voor nierontwikkeling onderzoeken, maar kan ook worden toegepast op normale en defecte morfogenese van andere organen zoals hart en lever te controleren. Bovendien kan de werkwijze worden gebruikt om verschillende dynamische processen in embryonale en volwassen modelorganismen zoals wondheling of regeneratie observeren.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Thomas Bates voor het kritisch lezen en het verbeteren van het manuscript. We danken ook Christina Ebert en Sabrina Stötzer voor vissen onderhoud.
Materials
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
| 0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
Referências
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O’Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
