配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析

所有动物实验均根据“实验动物护理的原则”以及关于动物保护的当前版本的德国法进行。 1.反义吗啉的制备（MO） 要准备3毫米MO原液，加100微升灭菌，超纯水的冻干MO（在玻璃小瓶300纳摩尔）。完全溶解，加热储备溶液至65℃5分钟。密封用封口膜的小瓶中并在室温下储存（RT）下将MO原液。不冷却在MO原液，因为这可能会导致在MO的关联与药瓶墙壁。 通过稀释的MO原液用无菌，超纯水制备1mM的MO工作溶液，并添加0.5％酚红溶液，以0.05％的终浓度。 要获得10微升MO工作液中，加入3.3微升MO原液和1微升0.5％酚红溶液5.7微升水。是前准备一批新的工作溶液加热MO原液至65℃5分钟。 在使用之前，离心机将MO工作溶液，以防止针堵塞。例如，旋转10微升的MO原液以15,000 xg离心5分钟（RT）并取下8微升上清液用于注射。 注：随着时间的推移11吗啉的解决方案，可能会出现活性损失。为了排除此，可以按照制造商提供的协议测试通过UV光谱法的解决方案，在吗啉降低的有效性尚未观察到在存储的长时间的使用wt1a的情况下，（3毫工作液储存超过一个长年）。 2.设置接合对受精卵的收集之前显微注射下午，建立5对的Tg（wt1b：GFP）线路，每在装有可拆卸的筛子以分离繁殖容器夜间男性和女性。 注：要确保有足够的鸡蛋，可为成功注入实验中，作为接合对鱼应该是预先筛选和评价为良好“生产者”。 第二天早上，开灯后，将男性和女性在一起，防止鱼类吃了他们的鸡蛋筛以上。 观看产卵。一旦被放置的蛋可以在4细胞期之前被注入的量再次达到从女性（约50），单独的男性。用巴氏吸管转移将鸡蛋打入培养皿装满胚胎水用于第一轮注射。为了让鸡蛋的额外回合，把一对交配在一起，分开几次。 3.显微注射准备工作注：提前执行步骤3.1和3.2。 要准备，注射（注射菜）期间保持在原位胚胎菜插入GL在40-45°角的屁股滑入94毫米的培养皿充满液体，透明，纯净，食品级硅。取出幻灯片当硅硬化。产生在硅层的槽。 注：另外，用1.5-3％琼脂糖代替硅和菜储存在4℃。 产生从用针拔出器的玻璃毛细管注射针。 使用含有内部细丝毛细血管。 注：灯丝将有助于回填（见3.3）后向针尖的MO解决运输。 在针拉马建立适当的设置。良好的针注射到斑马鱼应该有长而薄的技巧12。产生具有大约10毫米的长度，并在其最末端的直径为1.5-2微米的提示。例如，使用一个水平针车夫，设置如下：热= 330，拉= 0，速度= 40，时间= 100。 检查针的下一个质量解剖显微镜和梳理那些短或过长提示。 注：针短提示趋向而这种非常长的和薄的提示弯曲触摸绒毛膜时损坏胚胎和不穿透它。 通过使用微加载尖端回填2微升的MO工作溶液的针，并将其插入到注射装置的针保持器。 作为针在前端封闭，产生由捏背面用解剖显微镜下急剧镊子针的最末端的开口。另外也可以使用显微注射设备尖端轻轻推到坚硬的表面（ 如小金属块或镊子的背面）。 校准通过注入在MO工作液入放置在刻度矿物油的液滴的注射体积。调节喷射的持续时间用于产生75微米的水滴直径以获得约200复注射体积。 <p类=“jove_title”> 4。显微注射过程安排沿着具有朝向从在针来（朝向槽的45°角）的方向上的植物极显微注射培养皿的槽1-细胞期的胚胎。 穿孔绒毛膜和与针蛋黄和注入1mM的MO工作溶液（0.2皮摩尔）200复成1-蛋黄至2-细胞胚胎。 使用巴斯德吸管具有宽开口，收集所有的注射的胚胎在培养皿中填充有胚胎水中，并在28.5℃培养它们。 当天下午，通过使用巴斯德吸管用广口取出死胚和替换胎水。 5.准备胚胎的体内成像第二天早晨，用含有0.003％N-苯基硫脲（PTU）抑制黑化胚胎水取代胚胎水。原肠胚形成，因为它INTERF结束前不要使用PTUERES与早期胚胎发育。 注意：PTU是毒性和致畸。在任何时候都戴上手套，避免吸入以及直接接触皮肤。 Dechorionate在所需发育阶段解剖显微镜下用尖锐的镊子的胚胎。抓住绒毛膜一个镊子，并试图抓住绒毛膜的另一侧与第二镊子。小心拉在相反方向上镊子而不破坏胚胎。 通过用含有PTU（0.003％）和0.02％3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）胚胎水代替包含PTU胚胎水（0.003％）麻醉的胚胎。 琼脂糖嵌入在一个玻璃罩底μ-菜与一个50微米搬迁电网低熔点胚胎。适当的嵌入需要一些练习。 制备0.7％琼​​脂糖的1ml等份在1.5ml反应管，并把它们设定为36℃的加热块上。使用巴斯德吸管具有广泛的开放TRAnsfer胚胎μ-菜。删除使用巴斯德吸管采用超薄尖多余胚胎的水和覆盖与回火琼脂糖胚胎。 而琼脂糖仍然液体，定向在所希望的位二凝胶加载提示胚胎，关于感兴趣的结构以及对重定位网格的距离。放置的兴趣尽可能接近玻璃底部（这里：背侧向下）的结构（此处为前肾），并在紧挨着的网格。 为获得最佳的图像质量通过放置的胚胎尽可能接近底部的感兴趣结构最小化的胚胎和玻璃底之间的琼脂糖层。除此之外，定位在靠近附近向电网胚胎但照顾该网格将不与感兴趣的结构叠加。嵌入3-4胚胎在不同的μ-菜每使用定位最好的之一。 当琼脂糖很难足以容纳胚胎等待2-3分钟，并覆盖嵌入胚胎用含有0.003％PTU和0.02％三卡因胚胎水。倒出多余的胚胎的水或通过使用巴氏吸管超薄尖端移除。在锁定位置，以防止蒸发关闭μ-培养皿的盖子。 注：避免气泡的发生在μ-菜的，因为它们会损害图像记录。 6.显微镜注：使用配备通过结构照明的光学切片显微镜。图像记录包含以下模块软件：多通道，Z-Stack的，时间序列，软件自动对焦和扩展对焦。 Z-栈收购 反转μ-菜。玻璃底现在朝向物镜和μ-培养皿用作成像室。 切换滑块到网格位置和使能在软件控制结构照明模式。 校准通过下面的焦点校准向导的指示进行检查电网重点选择的通道（S）与试样（嵌入式胚胎）。 激活的Z-Stack采集模式，并将其设置为中心的模式。聚焦到试样的中间，并设置为通过点击中心 Z-堆栈的中心平面。通过定义围绕中心位置的范围内的z堆栈的尺寸。 注：对象结构不应被第一和Z堆叠的最后面以外急剧看到。 调整光部分之间的间距。为了达到最佳的z分辨率点击最佳按钮。基于该目标的景深的软件将设置以下奈奎斯特绕圈（50％重叠）建议的距离。 注意：如果瞄准较小的文件大小和结构许可，手动设置间距较大尺寸。设置非推荐较小的步骤只会导致更大的文件大小不增加以后人的信息。 时间推移成像 打开时间序列工具，并设置时间序列实验的时间间隔。例如记录Z堆栈图像在一段5小时每隔30分钟。 随着时间的推移修正焦点漂移，建立一个自动聚焦战略。检查聚焦战略对话中，从下拉列表中选择软件自动对焦并选择TL-明场通道作为参考通道。 先从自动对焦每个时间点。为了保证优化的时间框架内一个可靠的搜索范围，设定一个固定的200微米的相对的搜索范围。这个范围是完全在扫描最大步长（采样参​​数）（覆盖范围参数）基本品质（Quality参数）。 以提高自动聚焦精度，激活的兴趣（聚焦ROI），并位置的对焦区域内的计量所述周围的感兴趣结构的实时取景窗口焦点投资回报率。 注：如果系统缺乏软件自动对焦模块延时录制过程中自动更新中心z位置，暂停试验在给定的时间和手动调焦​​，并继续实验。 以时间序列记录期间补偿潜在的xy漂移，定位印迹格（的成像室）的一个特定点到软件的十字线并且通过使屏幕截图保存的定位。 开始的时间系列实验。的时间序列区间结束之前，暂停实验和，如果需要的话，定位根据截图重新调整。与实验继续。 7.图像处理切换到处理选项卡，选择对焦（EDF）在方法对话框中的扩展深度。由于光学切片被收购，应用最大投影算法对图像系列。 注：这里的算法将投影BRightest或从堆的复合2D图像中的第一步骤中的最暗的像素，并最终使用具有最高方差为每个时间点的结果的图像。 使用影片导出方法了EDF图像系列创建一个时间的推移电影（ 例如 AVI或移动文件）。