تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري
Summary
الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تطوير الجهاز في الأجنة الزرد باستخدام مضان تشريح المجهر قادرة على أداء باجتزاء البصرية واستراتيجيات بسيطة من التعديل لتصحيح الانحراف البؤري ومستو.
Abstract
من أجل فهم توالد، والتعديلات المكانية والزمانية التي تحدث أثناء تطور الأنسجة تحتاج إلى أن تسجل. الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين التنمية الكلى الطبيعية وضعف في الأجنة الزرد باستخدام المجهر مضان تشريح مجهزة للإضاءة منظم واكتساب ض المكدس. لتصور تكون الكلية، الزرد المعدلة وراثيا (تيراغرام (wt1b: GFP)) استخدمت هياكل الكلى مع fluorescently المسمى. وقد أثار عيوب الكلى عن طريق الحقن من النوكليوتيد العقاقير morpholino ضد wt1a ورم ويلمز الجين، وهو عامل من المعروف أن حاسمة للتنمية الكلى.
الاستفادة من الإعداد التجريبية هي مزيج من مجهر التكبير مع استراتيجيات بسيطة لحركات إعادة ضبط في العاشر والتوجيه ذ ض أو دون معدات إضافية. للتحايل على الانحراف البؤري التي يسببها تغيرات درجة الحرارة والاهتزازات الميكانيكية، تم تطبيق استراتيجية ضبط تلقائي للصورة بدلا من استخدام غرفة البيئية المطلوبة عادة. من أجل إعادة ضبط التغييرات الموضعية بسبب س ص العائمة، كانوا يعملون غرف التصوير مع شبكات نقل مطبوع.
بالمقارنة مع الاجهزة أكثر تعقيدا لتسجيل الوقت الفاصل مع باجتزاء البصرية مثل المسح الضوئي ليزر متحد البؤر أو المجاهر ورقة الخفيفة، المجهر التكبير من السهل التعامل معها. الى جانب ذلك، فإنه يوفر تشريح الفوائد المجهر معين مثل عمق مجال والعمل لمسافات طويلة.
ويمكن أيضا أن طريقة لدراسة توالد المعروضة هنا أن تستخدم مع المجاهر مضان ستيريو غير قادرة على باجتزاء البصرية. على الرغم من أن يقتصر على الإنتاجية العالية، هذه التقنية تقدم بديلا للمعدات أكثر تعقيدا التي تستخدم عادة لتسجيل الوقت الفاصل بين أنسجة النامية، وديناميات الجهاز.
Introduction
وبعد تكون المعيدة، توالد هو المرحلة التالية من دورة حياة الفرد. أنه ينطوي على إعادة ترتيب والتفاعل وفي كثير من الأحيان هجرة الخلايا لإنتاج الأنسجة والأعضاء. عدم دقة في العمليات الأساسية في تطوير أجهزة وغالبا ما يؤدي إلى الأمراض التي يمكن أن تعبر عن نفسها إما مباشرة أو أيضا في وقت لاحق في الحياة. وهكذا، فقد كان فهم توالد جهدا كبيرا في علم الأحياء التطوري والبحوث الطبية الحيوية. من أجل أن تكون قادرة على تحقيق التنمية من عضو معين، فإنه يجب أن تكون واضحة حتى من خلال جدار الجسم من الجنين. وهذا يتيح للتسجيل للتعديلات المكانية والزمانية التي تحدث أثناء التطور. أيضا من أجل تحليل أهمية العوامل التي تدخل في توالد، فإنه يحتاج إلى أن يكون عرضة للتلاعب.
أحد الكائنات الحية التي هي مناسبة جدا للتحقيق في الجسم الحي توالد هو الزرد. transpar لهاency أثناء التطور الجنيني في تركيبة مع استخدام خطوط المعدلة وراثيا الفلورسنت تتيح رصد توطين البروتين والتعبير ديناميكية، فضلا عن التصور من أجهزة الداخلية 1. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها فيما يتعلق بالتحقيق في تطوير الجهاز في الوقت الحقيقي بالمقارنة مع النماذج الثدييات التي الأجهزة لا يمكن الوصول إليها عن التحليل المجهري. وعلاوة على ذلك، تتوفر على التعامل مع التطور الجنيني من الزرد أدوات مختلفة. بجانب توليد خطوط متحولة، أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (MO) يمكن استخدامها لضربة قاضية نشاط معينة الجينات التي تشارك في تطوير بعض الأجهزة. المنظمات الأعضاء إما تستهدف موقع لصق أو متعدية بداية كودون (أغسطس)، وبالتالي تتداخل مع الربط ما قبل مرنا أو الترجمة.
الكلى الجنينية الزرد، وسليفة الكلوة، هو نموذج بسيط تشريحيا ولكن قيمة لدراسة تطوير الكلى وظيفة جنرالوفاق المتعلقة أمراض الكلى 2. وهو يتألف من وحدات وظيفية اثنين فقط تسمى النيفرون. ويتكون كل كليون من الكبيبة حيث يتم ترشيح الدم مكان 3. مكونات أخرى هي منطقة الرقبة قصيرة فضلا عن أنبوب صغير مجزأة لإفراز واستيعاب المواد المذابة والقناة، التي تنتهي في مجرور 4. بغض النظر عن تكوينها بسيط، تنظيم وأنواع مختلفة من الخلايا من سليفة الكلوة الزرد هي تشبه الى حد بعيد في الكلى الثدييات 5،6.
عامل واحد، وهو المشاركة حاسمة في تطور الكلى، يتم ترميز من يلمز ورم القامع الجينات WT1 7. الزرد تمتلك اثنين paralogs دعا wt1a وwt1b يجري التعبير عنه في نمط مماثل تداخل ولكن ليس خلال تطوير سليفة الكلوة 8. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا مع سليفة الكلوة هياكل GFP المسمى، وقد تبين أن كامل تدق إلى أسفل من wt1a </ م> أو من شكل لصق خاص يؤدي إلى تشوهات شديدة أو خفيفة في الكلى الجنينية، على التوالي 9،10.
الطريقة الموصوفة هنا يسمح تحليل الوقت الفاصل بين تكون الكلية الطبيعية وضعف في الأجنة الزرد عن طريق استخدام المجهر مضان تشريح مجهزة لباجتزاء البصرية عبر الإضاءة منظم. المقاطع البصرية بشكل عام تسمح اقتناء الصور التي تحتوي فقط على المعلومات في التركيز. خارج نطاق التركيز يمكن تجنبها المعلومات عن طريق نهج مختلفة مثل خوارزميات رياضية (على سبيل المثال. deconvolution)، التصميم البصري (على سبيل المثال متحد البؤر ليزر المسح المجهري) أو مزيج من الاثنين معا (مثل منظم الإضاءة).
للحث على عيوب في التنمية الكلى استخدمنا العقاقير MO ضد wt1a التي تم حقنها في خط الزرد المعدلة وراثيا (تيراغرام (wt1b: GFP)). ويظهر هذا الخط GFP مضان في الكبيبة والرقبة والجزء الأماميجزء من أنبوب صغير 9،10. بالمقارنة مع الاجهزة أكثر تعقيدا للتسجيلات الوقت الفاصل مع باجتزاء البصرية مثل المسح الضوئي ليزر أو المجاهر ورقة الخفيفة، المجهر التكبير من السهل التعامل معها وأقل تكلفة. وعلاوة على ذلك، معدات الإضاءة منظم يمكن بسهولة جنبا إلى جنب مع المعدات التقليدية مضان (على سبيل المثال مضان مصباح، مرشحات) والعروض تشريح المزايا مجهر محددة مثل المسافة العمل الموسعة وميدانية واسعة من الرأي. تم حل مشاكل مع الانجراف دون استخدام معدات إضافية (الغرفة البيئية، طاولة مضادة للاهتزاز) المطلوبة عادة للحصول على نتائج مستقرة. لتصحيح الانحراف البؤري تأسست استراتيجية ضبط تلقائي للصورة واستخدمت غرف التصوير مع شبكات نقل مطبوع لإعادة ضبط المواقع التالية الانجراف في اتجاه x أو ذ.
ويمكن أيضا أن تطبق الطريقة المعروضة على المجاهر بدون خيارات باجتزاء البصرية، مثل مضان ستيريو مicroscopes، ويقدم بديلا لأجهزة أكثر تعقيدا التي تستخدم عادة لتسجيل الوقت الفاصل بين أنسجة النامية، وديناميات الجهاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح الزرد كائن نموذج شعبية لدراسات التنمية الفقاريات ونماذج من الأمراض التي تصيب الإنسان. لأن الأجنة الزرد تبقى شفافة، الأجهزة النامية مثل المخ والقلب ويمكن ملاحظة باستخدام مجهر إعداد القياسية. الاستفادة من خطوط المعدلة وراثيا مع مضان محددة بالأعضاء تمكن تقييم توالد طوال مراحل التنمية المختلفة داخل الأجنة الحية بواسطة المجهر مضان. واحد الحد لتصوير التفاصيل الهيكلية للأجهزة كاملة مع المجهر epifluorescence هو معيار تأثير إشارات من كائنات فوق وتحت البؤري. على ضوء هذا خارج نطاق التركيز ليس فقط في النتائج تباين الصورة انخفضت والقرار، كما أنها قد تخفي الهياكل الهامة ذات الاهتمام 13،14. وقد تم تطوير العديد من التقنيات مثل confocal- المسح بالليزر، والغزل confocal- القرص أو المجهري multiphoton للحد من المعلومات خارج نطاق التركيز وبالتالي الزيادهتباين الصورة الإلكترونية وكذلك قرار المحوري. طريقة بديلة للحصول على المقاطع البصرية هو laser- والمسح الضوئي الحرة منظم المجهري الإضاءة، وحقل أساس تقنية الإضاءة واسعة هي وبسيطة لتنفيذ على المجهر العادي 15. النتائج المعروضة هنا توضح أن باجتزاء البصرية، من خلال الإضاءة منظم يتحقق، تنفذ على مجهر تشريح وجنبا إلى جنب مع إعادة بناء الصور التركيز الموسعة، يمكن تصور تفاصيل الهيكلية من المعتاد، واضطرب تنمية الكلى في الزرد. على وجه الخصوص، وفرقت الخلايا GFP إيجابية في morphants wt1a في أعماق الاتصال المختلفة، وسوف صورا لطائرة واحدة فقط مع التدريجي وغالبا التركيز طمس تقلل من تعقيد ثلاثي الأبعاد من النمط الظاهري.
لمتابعة ديناميات جهاز التنظيم وإعادة ترتيب أو اضطراب، والوقت الفاصل بين مضان المجهر هي قوية وإن كانت تقنية معقدة. خلال الوقت الفاصلالاهتزازات طفيفة التصوير أو التقلبات في درجة الحرارة الصغرى تسبب الانجرافات في X، Y ض أو الاتجاه. وهذا يتطلب معدات إضافية (غرفة البيئة، ومكافحة الاهتزاز الجدول) من أجل الحصول على نتائج مستقرة. يستخدم الطريقة المعروضة قدرة المجهر تشريح مع محرك التركيز الآلية لتسجيل الوقت الفاصل بين الصور من دون أجهزة إضافية. للحفاظ على التركيز مستقرة، وقد تم تأسيسها استراتيجية ضبط تلقائي للصورة، وكان يستخدم شبكة نقل مطبوع في الجزء السفلي من غرفة التصوير لتصحيح العاشر، وعدم الاستقرار Y-.
تضمين السليم للجنين هو خطوة حاسمة في البروتوكول. هناك حاجة إلى بعض الممارسات لوضع هيكل مصلحة أقرب وقت ممكن إلى أسفل الزجاج وفي الجوار القريب إلى الشبكة دون تتراكب مع ذلك.
والميزة الرئيسية للطريقة هو أنه أداة بأسعار معقولة وبسيطة للمراقبة المباشرة من العمليات التنموية مثل النمو والهجرة في المعيشةالأجنة على مدى عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، تشريح الفوائد المجهر معين مثل حقل كبير من الرأي والعمل لمسافات طويلة تسهل فحص عينات أكبر بما في ذلك أجهزة بأكملها. ومع ذلك، بعض القيود يجب أن يوضع في الاعتبار. التوقف التجربة للتحقق وتعديل المواقع يجعل الإجراء تستغرق وقتا طويلا وغياب التحكم في درجة الحرارة قوية يتغير وقت التنموية "قياسي"، الذي يعرف بأنه آخر ساعة الإخصاب في 28.5 درجة مئوية لمدة 16 الزرد. مشكلة محتملة أخرى هي عمق محدودة من التصوير في الحيوان، وخاصة عندما يقع بنية الفائدة داخل الجنين أو اليرقات. هذا الهيكل هو الكبيبة سليفة الكلوة الزرد، والتي تقع بين و somites والكيس المحي. تم العثور على عمق الحد لتصوير الكبيبة أن يكون حوالي 200 ميكرون، والمسافة التي يتم التوصل بعد 5 أيام من التنمية. في المقابل، الهياكل الفلورسنت التي هي لأوكاتيد أقرب إلى السطح من الحيوان ولا يمكن تصوير لفترة أطول. على سبيل المثال خلايا الكبد يمكن الوصول إليها للتصوير على الأقل حتى 9 DPF. وجود قيود آخر وهو أن تجميد طويل الأمد للجنين أو اليرقات في الاغاروز والعلاج تريكين لحث تأخر النمو وذمة القلب، على التوالي. لأن هذا قد تتداخل مع التطور الطبيعي، فمن المستحسن لتقييد مدة تسجيل مرور الزمن لفترة معينة من الفائدة. للتأكد من خلال الهياكل التصوير من مصلحة تطوير وعادة ما تكون مفيدة لمقارنة (في النهاية) المظهر العام مع أن حيوان أبقى تحت الظروف التجريبية نفسها ولكن من دون تضمين والتخدير.
تسجيل ض المكدس من المقاطع البصرية كل 30 دقيقة على مدى 5 ساعة وحساب لاحق من عمق الممتدة من الصور التركيز قدمت معلومات مكانية وزمانية عن الأحداث في وقت مبكر من المعتاد، واضطراب تنمية الكلى التي يسببها بضربة قاضية من wt1a ذ morpholino بوساطة. وقد أظهرت تؤديها سابقا morpholino ضربة قاضية التجارب بالفعل أن Wt1a يحقق دورا المبكر وأساسيا في تشكيل سليفة الكلوة في الموقع التهجين مع الكلى علامة 17،18 وتوظيف wt1b المعدلة وراثيا: خط GFP للتنمية سليفة الكلوة التصوير في وقت محدد يشير 9،10 كشف أن النتائج نقص wt1a في التشكل الكبيبي تعطلت وفشلت مواصفات خلية رجلاء. وعلى النقيض من هذه الأساليب ثابتة والتسجيلات الوقت الفاصل بين تصور مباشرة ديناميات تكون الكلية الأولى في الأجنة التحكم وهجرة الخلايا GFP إيجابية بعيدا عن المنطقة سليفة الكلوة في morphants wt1a. إمكانية تعقب الخلايا misrouted يعد مرور الوقت يسمح للتحليل أكثر تفصيلا النمط الظاهري.
بشكل عام، فإن الطريقة التي يتم عرضها هنا يوفر غير مكلفة وسهلة الاستخدام بديل للمجمع، ويصعب الوصول إليها ذاتهاtups تستخدم عادة لتصوير مرور الزمن مثل مجهر المسح بالليزر (مجهزة الغرفة البيئية والجدول مضادة للاهتزاز) أو ضوء المجهر ورقة. الروتين وصفه لإصلاح مشاكل الانحراف يمكن أن تطبق أيضا على أداء الوقت الفاصل بين الصور على الاجهزة بدون خيارات باجتزاء البصرية، مثل المجاهر مضان ستيريو.
هذه التقنية ليست فقط مناسبة لتحقيق تنمية الكلى ولكن يمكن أن تطبق أيضا لمراقبة التشكل الطبيعي وعيب من الأجهزة الأخرى مثل القلب أو الكبد. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة مختلف العمليات أكثر ديناميكية في الكائنات الجنينية والكبار نموذج مثل التئام الجروح أو تجديد.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر توماس بيتس لقراءة ناقدة وتحسين المخطوطة. كما نشكر كريستينا ايبرت وسابرينا Stötzer لصيانة الأسماك.
Materials
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
| 0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
Referências
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O’Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
