Influensa A-virus (IAV) är ett höljevirus och tillhör familjen Orthomyxoviridae. Dess gener kodas på en segmenterad, negativ-sense och enkelsträngat RNA-genomet. Hos människor orsakar IAV luftvägsinfektioner, som förekommer i säsong utbrott epidemiska och bär risken för globala pandemier ^1. Vid bindning till sialinsyrarester på värdcellytan ^2, är IAV internaliseras av clathrin-beroende endocytos och clathrin oberoende vägar ^3-8. Den sura miljö (pH <5,5) i de endocytiska vakuoler utlöser en stor konformationsförändring i IAV spik glykoprotein hemagglutinin (HA), vilket resulterar i fusion av det virala och den sena endosomala membranet ^9. När väl IAV kapsiden (här även hänvisad till som viral "kärna") har undkommit från sena endosomer (LES), är det inte belagda i cytosolen följt av transport av de virala ribonukleoproteiner (vRNPs) in i kärnan – platsen of virusreplikation och transkription ^10-13. Innan syraaktivering av HA viruset upplever en gradvis minskning av pH i den endocytiska systemet, som primär kärnan för dess efterföljande demontering ^14-16. I denna "priming" steg M2 jonkanaler i virusmembranet mediera tillströmningen av protoner och K ^+10,14,16. Förändringen i jonkoncentration i virus inre stör samspelet bygga upp av den virala matrisprotein M1 och åtta vRNP bunten, och underlättar IAV uncoating i cytoplasman efter membranfusion ^10,14-17.

Direkt och kvantitativ analys av evakueringssteget har hindrats av det faktum att endosomer är svåra att komma åt experimentellt. Inmatningsprocessen är för övrigt i hög grad icke-synkron. Dessutom har end-point-analyser, såsom QRT-PCR av frigjorda virala RNA eller infektions mätningar, inte ge en detaljerad bild av den biokemiska tillstånd virala Capsid vid varje givet steg av posten. Även störning av endosomer av siRNA eller läkemedelsbehandling har väsentligt bidragit till förståelsen av IAV inträde ^{18-20,-tuning} bra är svårt och benägna att ospecifika biverkningar i hårt kontrollerad endosomen mognad program.

För att undvika dessa problem, har vi anpassat en tidigare utvecklad in vitro-protokoll baserat på användningen av hastighets gradientcentrifugering ^17. Till skillnad från andra försök ^{21,22, 23,24,} som oftast var baserade på kombinationer av proteolytisk klyvning och tvättmedel behandling följt av EM analys, detta tillvägagångssätt möjliggjorde en lätt mätbar resultat. Centrifugering genom olika lutning lager tillåter sedimente partiklarna att utsättas för och reagera med förändrade förutsättningar på ett kontrollerat sätt. I den presenterade protokollet, IAV härrörande från klar allantoisvätska eller renade virala partiklar sedimenteras till en två-lagers glycerolgradient i vilken det undre lagret innehåller den icke-joniska detergenten NP-40 (Figur 1). Eftersom viruset kommer in i andra, tvättmedel som innehåller lager, de virus lipid kuvert och kuvert glykoproteiner försiktigt solubiliseras och kvar. Kärnan, som består av den åtta vRNP knippet och omgiven av ett matrisskikt, sediment som en stabil struktur in i pelletfraktionen. Virala kärnproteiner, till exempel M1 och vRNP-associerad nukleoprotein (NP), kan identifieras i pelleten med SDS-PAGE och Coomassie-färgning. I synnerhet dra nytta av kommersiellt tillgängliga gradientgeler och färgning med den mycket känsliga kolloidalt Coomassie ^25, möjliggör hög precision och detektion av även små mängder av viruskärn associerade proteiner.

Detta utgör grunden för att testa om olika förhållanden såsom pH, saltkoncentration, och förmodade uncoating faktorer har effekter på sedimenteringsbeteende kärnkomponenter och kärn stabil heten. För detta syfte, är endast den nedre, detergent-innehållande skikt i glycerolgradient modifieras genom införande av faktorn eller ett tillstånd av intresse. Tekniken har varit särskilt värdefullt att utreda effekten av olika pH-värden och saltkoncentrationer på integritet IAV kärnan ^16. Mellanliggande steg av IAV uncoating kunde övervakas inkluderande dissociation av matrisskiktet vid milt surt pH (<6,5) följt av vRNP dissociation vid pH 5,5 och lägre ^16,17 (Figur 1). Det senare steget förstärktes ytterligare genom närvaron av hög K ⁺ koncentration i glycerolskiktet, vilket återspeglar en sen endocytiska miljö ^16. Således, eftersom viruset och kärnan sedimente genom gradienten de upplevde en föränderlig miljö som efterliknar förhållandena i endosomer. Resultatet var en stegvis demontering av den virala kärnan in vitro komplement resultat som härrör från cellbiologiska analyser.