암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

여기에 설명 된 인체 조직을 사용하는 모든 실험은 로컬 윤리위원회 (하기 Rif. N. 12분의 141)에 의해 승인되었다. 조직 샘플의 수집 및 샘플의 사용 및 저장에 대한 동의는 AOUC의 기증자로부터 얻은 것입니다. 문화 1. 준비 10 % 우태 혈청 (FBS), 100 IU / ml의 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 쿤 변성 햄 F12 배지에 첨가하여 성장 배지 (GM)을 준비한다. 필터 및 0.22 ㎛의 필터를 이용하여 멸균 GM. 최대 1개월 4 ° C에서 보관 GM. 쿤 변성 햄 F12 배지에 20 % FBS, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 II 형 콜라겐을 첨가하여 배지 (CM)을 준비한다. 필터 및 0.22 ㎛의 필터를 이용하여 CM 살균. 에게 1 달 -20 ° C에서 보관 CM. 40 % FBS를 추가하여 (FM)를 동결 세포에 대한 매체 준비, 100 IU / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 (6)쿤의 수정 햄의 F12 매체에 0.5 %의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO). 필터 0.22 μm의 필터를 사용하여 FM을 소독합니다. 최대 1개월 4 ℃에서 보관 FM. 쿤의 수정 햄의 F12 매체에 20 % FBS, 100 IU / ml의 페니실린과 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신을 추가하여 CFU 분석 (㎖,)에 대한 매체를 준비합니다. 필터는 0.22 μm의 필터를 사용 ㎖, 살균 및. 스토어 ㎖, 1개월까지 4 ° C에서. ml의 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 2 + 칼슘과 마그네슘없이 1000에서 포도당 무수 – 400 mg의 트립신, 200 mg을 EDTA 1,000 mg을 D (+)를 용해하여 트립신을 준비합니다. 참고 : 최대 3 개월 동안 -20 ° C에서 0.22 μm의 필터와 동결을 사용하여 25cm에 50 ml의 분취 액에 2 플라스크 신선한 트립신 EDTA를 나눈다. 스토어 활동의 손실없이 4 ° C에서 필터 살균 분취 량을 해동. 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ streptom 10 % FBS를 첨가하여 줄기 세포 성장 배지 (SCGM)를 준비쿤의 수정 햄의 F12 매체에 ycin, 10 NG / ㎖의 bFGF (25 μg의 / ㎖ 주). 4 ° C에서 이주까지 0.22 μm의 필터와 매장 SCGM를 사용하여 SCGM를 필터링합니다. 3 일 동안 39 ° C에서 초순수 H 2 O에 MC에 용해시켜 2 % 메틸 셀룰로오스 (MC)를 준비한다. MC가 완전히 용해 될 때, 오토 클레이브를 4 ℃에서 저장한다. 참고 : MC는 멸균 후에는 고체가된다. 4 ℃에서 액체 상태, 가게에 MC를 가져올 수 있습니다. sarcosphere 성장 매체 (SGM)를 준비합니다. , 100 μg의 / ㎖ 인간의 bFGF (25 μg의 / ㎖ 주) 100 IU / ml의 페니실린을 추가하여이 매체 신선한 (안 2 주 이상 사용 전) 준비, 20 nM의 프로게스테론 (10 μM 주), 100 μM의 퓨 트레 신, 30 nM의 아 셀렌 산 나트륨 (30 μM 주), 25 μg의 2 배에 / ㎖ 트랜스페린 (25 ㎎ / ㎖ 주), 20 μg의 / ㎖ 인슐린 (20 ㎎ / ㎖ 주), 10 NG / mL의 인간 EGF (10 μg의 / ML의 주) 쿤의 햄의 F12 매체를 수정했습니다. 필터 및 0.22 ㎛의 FIL를 사용 SGM 살균터. 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장합니다. (10 % FBS (미국 남부 출신), 100 IU / ml의 페니실린, / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 나노 덱사메타손 (100 μM 주) 100 μg의 0.2 mM의 나트륨 L – 아스 코르 빈산 -2- 인산을 첨가하여 1 골 형성 매체 (OM)를 준비 M 주식), 쿤의 수정 햄의 F12 매체에 10 MM의 β-글리세 (5 ㎎ / ㎖ 주) 1 μg의 / ㎖ 칼 세인 (200 μg의 / ㎖ 주). 필터는 0.22 μm의 필터를 사용 OM을 소독. 4 ℃에서 보관하십시오. 주 : 액체 질소하에 저장 덱사메타손 원액 그들의 활성을 유지한다. 매체의 분화 잠재력을 유지하기 위해 덱사메타손의 활성을 유지하기 위해 2 주마다 신선한 OM을 준비한다. 1.66 mg의 NH4Cl를 용해시켜 0.2 mg의 K 2 HPO 4 200 ㎖ 중의 0.007 밀리그램 EDTA 증류수 (DH 2 O)을 적혈구 세포 용해 완충액 (ELB)를 준비한다. 필터 및 0.22 ㎛의 필터를 이용하여 멸균 ELB. 4 °에서 보관기음. 추가하여 지방 세포 매체 (AM)를 준비 10 % FBS (남미 원산지), 100 IU가 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 1 μM 덱사메타손 (1 밀리미터 주), 1 μM 소 인슐린 (10 mM의 주식), 0.5 mM의 이소 부틸 (IBMX) (500 밀리미터 주)와 쿤의 수정 햄의 F12 매체에 100 μM의 인도 메타 신 (200 mm)이다. 필터 및 0.22 μm의 필터를 사용하여 AM 소독. 4 ℃에서 보관하십시오. 주 : 액체 질소하에 저장 덱사메타손 원액 그들의 활성을 유지한다. 매체의 분화 잠재력을 유지하기 위해 덱사메타손의 활성을 유지하기 위해 2 주마다 신선한 AM을 준비한다. 준비 2 % DPBS에 소 혈청 알부민 (BSA) (BSA / DPBS). 500㎖의 DPBS에 10g의 BSA를 용해시키고, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 50 mL의 원액을 aliquotting하여 스톡 용액을 제조 하였다. -20 ° C에서 보관하십시오. DPBS (PFA / DPBS) 중 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 용액을 준비한다. 채널에서emical 후드는 DPBS에 파라 포름 알데히드를 희석하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 50 mL의 원액을 aliquotting하여 스톡 용액을 제조 하였다. 4 ℃에서 보관하십시오. 2. (OSA) 1 차 OS 세포 배양 및 OS 유한 세포주를 수립 참고 : 기본 OS 세포 배양은 "자 Unit ORTOPEDIA Oncologica 전자의 Ricostruttiva", AOUC Careggi, 피렌체에서 수집 된 기존의 OS 생검의 신선한 샘플로부터 제조 하였다. 침 흡인 또는 종양 (도 1A, B)의 작은 부분의 수술 적 절제에 의해 수득 된 모든 생검 즉시 100 IU / ml의 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (PH 7.4)로 보충 된 배양 배지에 넣고 그들은 처리 된 실험실로 이송. 모든 기술 된 조작은 층류 후드를 이용하여 무균 조건 하에서 수행 하였다. OS 세포의 분리 A의 조직 검사를 배치GM의 작은 볼륨 100mm 페트리 접시. 무균 란셋 페리 핀셋으로 가능한 한 작은 피스로 절단하여 OS 조직 샘플을 말하다 (0.5-1 ㎜) (도 2A, B). 효소 소화 (그림 2B) 10 ML의 CM으로 조직의 조각을 덮고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 3 시간 동안 배양. 조심스럽게 피펫을 사용하여 조각의 정지를 제거하고 조각을 펠렛 즉각적인 원심 분리 (5 분 400 XG)의 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 주 : 생검 적혈구 풍부하면 원심 분리 후, 적혈구 이루어지는 적색 입금 프래그먼트 통해 알 수있다. 따라서, 기계적 분산으로 진행하기 전에, 적혈구 용해 버퍼와 샘플을 취급합니다. 흡인에 의해 뜨는을 취소하고 5 ML의 ELB를 추가합니다. 1 분 동안 펠렛 조각을 일시 중단하고 2 400 XG에 현탁액을 원심 분리분. 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. 20 회 – 10 ml의 혈청 학적 피펫 (눈 크기, 1.5 mm 내부 Ø) (10)를 사용하여 조각을 분산 기계적으로 5 ml의 GM을 추가합니다. 5 분 동안 400 XG에 현탁액을 원심 분리기. 흡인하여 상등액을 제거 10 ㎖ GM과 세포 펠렛을 중단 한 후 100mm 페트리 접시로 얻어진 세포 현탁액을 전송. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 배양 접시를 품어 신선한 완전한 GM 매 3 D로 GM을 교체합니다. 참고 : 매우 자주, 침 흡인에 의해 얻어진 OS 조직 샘플은 콜라게나 제와 효소 분해에 의해 소화되지 않은 뼈 조각, 매우 작고 포함되어 있습니다. 상등액을 제거한 후 따라서 피펫 펠릿 단편을 당화함으로써 뼈 조직으로부터 세포를 분리하기 위해 시도한다. 하위 문화 참고 : 세포가 대략 합류에 도달 할 때 OSA을 설정하려면, 파묻혀에서 제거R 문화 용기, 희석 및 추가 성장을 가능하게하는 신선한 접시에 배치합니다. 이러한 배양 과정은 트립신 불리는 효소 절차를 사용하여 달성된다. 흡인 매체를 제거합니다. – (20 ° C 최대 18) 부드럽게 한 번 흔들어, 흡인에 의해 즉시 트립신을 제거 실온에서 3 ㎖ 트립신 – 세포 단일 층을 해리하려면 2를 추가합니다. 두 번 반복합니다. 그들은 분리하기 시작할 때까지 4 분 – 3 37 ° C에서 세포를 품어. 참고 : 좋은 트립신은 요리가 빛을 개최 할 때 약간 불투명 한 단층을 형성하는 작은 구멍으로 경험 사용자가 볼 수 있습니다. 이 분리는 역 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다 이 방법은 초보자에게 추천합니다. 10 ml의 GM을 추가하여 트립신 반응을 중지하고 모든 세포를 분리하기 위해 피펫을 사용하여 잘 접시를 씻으십시오. 전송 한 새로운 100mm 페트리 접시에 정지 ㎖의 9 ml의 GM (세포의 1/10 분할)를 추가합니다. 노트: </stroNG> 나머지 세포 현탁액은 세포 확장 (다른 100mm 페트리 접시로 전송)에 사용할 수 있습니다 (2.3 절 참조) 동결 보존 할 수있다, 또는 실험적인 요리 또는 증식 분석 또는 다른 목적을 위해 우물 (참조에 계산 및 도금 될 수있다 이하). OS 차 문화와 OSA의 냉동 보존 참고 : 4-5 크리오 바이알 (cryovial)에 하나의 합류 100mm 페트리 접시를 고정. 냉동 보존 공정은 동결 중에 세포막 보호 DMSO가 비 냉동 온도에서 세포 독성이 있기 때문에 신속하게 수행되어야한다. 트립신에 의한 단층에서 세포 배양을 해리, 5 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포 (2.2 절 참조) 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 신속 FM의 세포 펠렛을 일시 중지합니다. 나누어지는 극저온 유리 병 당이 현탁액 1 ㎖. 즉시 2- 프로판올 및 저장 최단 당일의 재킷 냉장고 상자에 충전 된 튜브를 배치tely -80 ° CO / N에서. 전송은 액체 질소에 장기 저장을 위해 다음날 크리오 바이알 (cryovial). 제상 OS 세포주 및 일차 배양 액체 질소에서 보관 제상 OS 세포주, 37 ° C에서 실험 수조에 배치하여 급속 해동 크리오 바이알 (cryovial). 15 ML 원뿔 튜브에 크리오 바이알 (cryovial)의 내용을 전송하고 GM의 약 10 ml에 (DMSO를 제거하기 위해 2.3 절 참조)에 추가합니다. 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 10 ml의 GM의 세포 펠렛을 일시 중지합니다. 100mm의 페트리 접시에 세포 현탁액을 접시 및 37 ℃, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양한다. 3. Sarcosphere 분석은 분리하는 OS-암줄 기세포 참고 :이 실험은 OSA에서 수행됩니다. 이 실험 기간은 이들 구체 콜로니 (sarcospheres)을 형성하는 세포의 능력에 관련된 시간 내지 7, 14, 21, 및 28 (D)이다. 맛 음료sarcosphere 분석의 lishment 혈구 챔버와 사전에 모든 시약을 준비합니다. 흡인 배지를 제거하고 트립신 처리에 의해 단일 층의 세포를 해리 (섹션 2.2 참조). 피펫 어떤 덩어리를 분산하고, 20 μL 피펫 팁을 사용하여 10 μL를 수집 철저히 세포 현탁액을 혼합한다. 상기 혈구 챔버 에지 바로 10 μL 세포 현탁액을 전송 현탁액을 배출하고,이 모세관 현상에 의해 커버 슬립에 따라 그려 질 수 있도록. 위상차에서 혈구 실을 준수하십시오. 10 배 목표를 선택하고 챔버에서 그리드 선에 초점을 맞 춥니 다. 계산에 대한 지원으로 (또한 세 개의 평행선 구속)가 하위를 사용하여이 1mm 2 지역에 누워 세포와 단일 그리드 선을 계산합니다. 농도를 측정하고 다음 식에 적용 (1 mL의 = N * 104 / z를 N : 카운트 모든 셀의 전체 개수사각형 1mm 2; Z : 계산 사각형 1mm 2)의 수. 6- 웰 초저 부착 플레이트에 웰마다 40,000 세포로 분할 240,000 세포의 총량 판형에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산한다. 참고 : 하나의 여분의 우물에 세포를 도금 세포의 정확한 수를 판해야합니다. 따라서, 도금 될 세포의 총량은 28 세포이다. 25 cm2로 플라스크에 2 % MC (SGM-MC)의 50 %를 첨가하여 35 ml의 SGM을 준비한다. 엑스트라 웰 플레이트에는 별도 5 mL를 고려 SGM의 총량을 준비한다. 플라스크에서 제조 한 SGM-MC의 세포 현탁액의 계산 된 볼륨을 추가하고 덩어리를 분산하기 위해 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 6 잘 초저 부착 판에서 세포를 플레이트 및 도금 후 세포가 표시되는 방식을 관찰하기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션. 모든 3 d를, FR 추가각 웰의 bFGF와 EGF의 ESH 분취 량은 상기 성장 인자의 농도를 새로. 물론 각 10 ng를 / ㎖의 최종 농도에서 모두를 유지하기 위해 2 μL의 bFGF 5 μL EGF를 추가합니다. sarcospheres의 분리 참고 :이 형성된 sarcospheres을 분리 할 필요가있다시기를 결정하기 위해 7, 14, 21, 28 D에 sarcosphere 분석의 좋은 진행 상황을 모니터링합니다. 층류 후드 (도 3A, B)의 모든 시약 및 장치를 준비한다. 25mm 직경의 넷 필터 및 멤브레인 필터 홀더에 40 ㎛의 메시를 배치하여 여과 유닛을 조립; 오토 클레이브 (그림 4A-E)에 의해 소독. 각 웰 들어, 1000 μL 팁으로 멸균 피펫을 사용하여 멸균 멤브레인 필터 홀더와 주사기에 sarcospheres을 함유하는 배지를 옮긴다. 완전히 sarcospheres을 함유하는 배지를 제거한 후, 추가로 잘 씻어5 ml의 GM을 보내고은 주사기에 모든 분야를 전송해야합니다. 모든 sarcospheres 복구되었는지 여부를 확인하기 위해 현미경을 사용합니다. 그렇지 않은 경우,이 단계를 반복하여 진행합니다. 구체의 손상을 방지함으로써 분야의 손실을 피하기 위해, 필터를 통해 교차 갖는 sarcospheres을 피하기 위해 압력 않고 중력에 의해 막 필터 홀더 현탁액 필터. 부드럽게 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 기포를 제거합니다. 주 : 때때로 여과 멤브레인 필터 홀더에 기포의 존재에 의해 차단된다. 주사기에 10 ml의 GM을 추가하고 단일 세포를 제거해야하는 압력없이 필터링 할 수 있도록함으로써 여과 장치를 씻으십시오. 주사기에서 필터 유닛을 분해하고 페트리 접시에 넣어. 페리 핀셋을 사용하여 멤브레인 필터 홀더에서 그물 필터를 제거하고 60mm에서 핀셋으로 가볍게 흔들어 씻어페트리 접시는 멤브레인의 복잡하게 얽힌에서 sarcospheres를 분리합니다. 이어서, 웰 막을 배치하고 막에 얽힌 더 구체 없는지 현미경 관찰에 의해 확인한다. 분야는 여전히 막에 얽힌 경우 단계 3.2.4에 기술 된 바와 같이, 다른 세척 진행합니다. 현미경을 사용하여 출시 sarcospheres을 준수하십시오. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 방출 된 sarcospheres을 품어. 6 잘 초저 부착 판의 각 웰에 대한 모든 단계를 반복합니다. 4. OS-CSC 라인 참고 : OS-암줄 기세포는 재 소개하고 그들이 매우 낮은 부착 조건에서 더 이상 mm 60 작은 배양 접시에 도금 후 단층에서 이러한 세포를 reculturing 없다하여 부착 확장을 나타내는 sarcospheres에서 얻을 수 있습니다. OS-CSC 문화 그들은 60에서 약 90 %의 합류에 도달하면 추가 성장, 배양 세포를 활성화하려면mm 페트리 접시. 단계를 반복 2.2.1 OS-CSC 문화를 설정합니다. 모든 세포를 분리하기 위해 피펫을 사용하여, 4 ml의 SCGM을 추가하여 트립신 중지하고 잘 접시를 씻으십시오. 새로운 100mm 페트리 접시에 세포 현탁액을 전송하고 6 ml의 SCGM를 추가합니다. OS-암줄 기세포는 2.2 절을 반복하여 90 %의 합류, 서브 컬쳐에 도달하면. 주 : 격리 된 CSC-OS의 줄기 세포와 유사한 표현형을 특성화하기 위해 시험 관내 분석을 위해, 세포를 플레이트의 종류에 도금 될 수있다. 냉동 보존에 의해 설립 OS-CSC 라인 (섹션 2.3의 모든 단계를 반복) 유지. 2.4의 모든 단계를 반복하여 냉동 보관 OS-암줄 기세포를 해동. 5. 시험 관내 nalysis는 OS-암줄 기세포의 특성을 : 면역에 대한 세포의 준비 주 :이 24도 괞 찮아의 각 웰에 합류의 오른쪽 등급에 도달하면 세포 파라 포름 알데히드에서 해결테. 합류점의 등급은 실험의 유형에 관한 것이다. 플레이트 OS-암줄 기세포 면역에 의해 표면 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 마커를 연구하는 24 웰 플레이트입니다. 60 % 합류 – 그들이 50에 도달하면 각 웰의 세포를 수정. 흡인에 의해 SCGM를 제거하고 DPBS 24 웰 플레이트에 두 번 씻는다. 화학 후드에서 각 웰에 500 μL 4 % PFA / DPBS를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. 재정법 / DPBS를 제거하고 초순수 DH 2 O.와 배를 씻어 24 웰 플레이트는 흄 후드에서 건조하도록 허용합니다. MSC 마커에 대한 면역 주 : OS-CSC 추가의 면역 형광 염색는 4 % PFA / DPBS 고정은 CD44, STRO-1, CD105에 대한 항체를 사용하여 OS-CSC 추가의 MSC와 같은 표현형을 조사하는데 사용될 수있다. 다음 방법은 저자가 일상적으로 사용됩니다. 화학 후드에서 μL 0.2 (500)를 추가하여 4 % PFA / DPBS에서 수정 된 세포를 Permeabilize 하시려면% 트리톤 X-100 / 웰로 각각 DPBS. 30 분 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 조심스럽게 세포가 DPBS로 3 배 씻는다. 300 μL의 RNase가 2 % BSA로 1 / 1,000으로 희석 추가 / 셀 DPBS 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 조심스럽게 세포가 2 % BSA / DPBS로 3 배 씻는다. MSC 마커에 대한 세포 얼룩. 각 항체 양성 대조군으로 선정 우물에 차 항체를 추가합니다. 추가 300 μL 안티 CD105 안티 STRO-1는 2 % BSA / DPBS로 1/10 희석하여 300 μL 항 CD44은 2 % BSA로 1/10 희석하여 300 μL, 2 % BSA / DPBS / DPBS로 1/10 희석 만 200 μL 2 % BSA / 각 항체 음성 대조군으로 선정 우물에 DPBS. 4 ° CO / N에서 습한 환경에서 세포를 품어. 우물이 2 % BSA / DPBS로 두 번 다음 DPBS로 3 배 및 씻으십시오. 특정 이차 항체를 추가하여 일차 항체를 알 수있다. 300 μL 항 – 토끼 IgG를가 (당나귀 항 토끼 IgG를 [H + 1]가) 1/100 희석 추가2 % BSA와 함께 / 잘 CD44와 CD105 양성 및 음성 대조군으로 선정 각각에 DPBS. 2 % BSA로 1/100 희석 300 μL FITC 안티 – 마우스 IG (FITC-토끼 항 – 마우스 IgG [H + L]을) 추가 / 각 웰 STRO-1 양성 및 음성 대조군으로 선택로 DPBS. 60 분 동안 실온에서 어둠 속에서 세포를 품어. 우물이 DPBS로 6 배 씻으십시오. 2 % BSA로 희석 1/100 Phalloidin의 300 μL를 추가하여 세포 골격 액틴을위한 얼룩 MSC 마커 양성 세포 / 웰 MSC 마커 면역에 대한 스테인드 각에 DPBS. 실온에서 40 분 동안 세포를 품어. 우물이 DPBS로 3 배 세척 한 후 초순수 DH 2 O.로 두 번 씻어 위에서 설명한 면역 형광 염색 후 핵으로 대조를 진행합니다. 흄 후드에서 M DPBS (주 1.5 × 10-3 M)에 요오드화 프로피 듐 솔루션 10-5을 준비합니다. 각이 잘 상술 한 바와 같이 색깔에 200 μL 프로피 디움 요오드 용액을 추가합니다. 셀을 품어RT에서 3 분 – 2의. 초순수 DH 2 O.로 두 번 우물을 씻으십시오 주 – 세포주 HCT8 5.2, 음성 대조군으로 사용되는 주 연속 차별화 결장암 세포주 섹션 5.1의 모든 단계를 반복한다. 골 형성 분화 분석 주 : 골 형성 분화는 20 일 동안 지속됩니다. SCCGM 1 × 104 세포 / cm 2의 세포 밀도에서 24 웰 플레이트에 플레이트 OS는-암줄 기세포. 물론 각각 90 % 컨 플루 – 그들은 80에 도달 할 때까지 세포가 SCGM에서 성장 할 수 있습니다. OM에 SCGM을 변경하여 골 형성 분화를 시작합니다. 4 D – 세포가 OM 성장과 매체 매 3를 새로 고칠 수 있습니다. 알칼리성 포스파타제 (ALP)의 존재를 평가하기 위해 10 D의 골 형성 분화 분석을 중지합니다. 4 % PFA / DPBS에 세포를 수정 (5.1 절 참조). ALP과 HA에 대한 세포 화학적 염색에 의한 조골 세포 표현형을 평가알리자린 레드 S 염색을 사용. ALP 세포 화학적 염색 주 : 즉시 염색을 시작하기 전에 화학 후드에서 염료 혼합물을 준비합니다. 40 mg을 녹이고 빠른 블루 BB 50 ml의 트리스 – 염산에 빠른 레드 바이올렛 LB 소금, pH가 9 (용액 A). 1 ml의 DMSO (솔루션 B) 5 mg을 나프톨 AS-MX 인산 나트륨 염을 용해. 완전히 해결 방법에 용액 B를 추가하고 DPBS로 두 번 솔루션 C. 워시 세포를 획득, 잘 섞는다. 각 웰에 1 ml의 솔루션 C와 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 % – 500 μL를 추가합니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 매 10 분 염색 과정을 모니터한다. ALP 양성 세포가 집중적으로 일반적으로 30 분 이내에 발생 (고속 레드 바이올렛 LB 소금 빠른 블루 BB 염 또는 빨간색과 파란색)를 착색 될 때 염색을 중지합니다. 세포가 초순수 DH로 3 배 씻어 2 O는 경우 해결 방법 C의 모든 잔류 물을 제거하는 얼룩의 난의 침전물본이야, 무수 에탄올 빠르게 한 번 세포를 씻으십시오. 단계 5.2.5 및 5.2.5.1에 ​​설명 된대로 ALP 염색 후 핵으로 대조를 진행합니다. 알리자린 레드 S 세포 화학적 염색 주 : 실험을 시작하기 전에 염료 혼합물을 준비한다. (초순수 H 2 O 100ml에 2g 알리자린 레드 S) 2 % 알리자린 레드 S를 준비합니다. pH가 6.0에 도달하기 위해 2 % 알리자린 레드 S 2.5 % NH 3를 추가합니다. 4 ℃에서 보관 2 % 알리자린 레드 S 솔루션입니다. DPBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 단 몇 초 동안 세포에 알리자린 레드 S를 추가합니다. 초순수 DH와 염색의 정도를 제어하는 2 O를 우물을 씻으십시오; 는 HA 보증금은 강렬한 색이 아닌 경우, 단계 5.3.5.2를 반복합니다. HA 예금은 보통 몇 분 이내에 발생하는, 색의 강렬한 빨간색이되면 염색을 중지합니다. 초순수 DH 2 O와 우물을 씻으십시오 </li> 지방 세포 분화 주 : 분석 기간은 OS-CSC 라인에 따라 달라집니다. 30 D – 분석은 14 지속될 수 있습니다. SCGM 1 × 104 세포 / cm 2의 세포 밀도에서 24 웰 플레이트에 플레이트 OS는-암줄 기세포. 물론 각각 90 % 컨 플루 – 그들은 80에 도달 할 때까지 세포가 SCGM에서 성장 할 수 있습니다. AM하는 SCGM을 변경하여 지방 세포 분화를 시작합니다. 세포가 AM에서 성장하고 일주일에 두 번 오전를 새로 고칠 수 있습니다. 지질 소포를 볼 수 있습니다 때 지방 세포 분화 분석을 중지합니다. 오일 레드 O 염색에 의한과 핵에 대한으로 대조 헤 마톡에 의해 지방 세포 표현형을 평가합니다. 핵에 대한 헤 마톡의으로 대조 주 : 실험을 시작하기 전에 염료 혼합물을 준비한다. Emallume Carazzi (39)라는 5 % 헤 마톡 솔루션을 준비합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 단지 2 분 동안 Emallume Carazzi를 추가합니다. ULT와 우물을 씻으십시오rapure DH 2 O. CFU 분석 참고 :이 실험은 3 회 반복 수행해야합니다. 플레이트 OS-암줄 기세포 100mm 배양 접시에있는 ㎖, 450 세포 / cm 2의 셀 밀도. 4 주간 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 품어. 일주일에 두 번 ㎖, 새로 고침. 톨루이딘 블루와 CFUs를 얼룩. 거꾸로 현미경을 사용하여 컬러 식민지를 계산합니다. 다음 식에 따라 CFU 효율을 계산한다 (콜로니 수 / 세포의 수가 시드) * 100. ALDH 활성 분석 참고 ALDH 활성은 두 OS-CSC 라인 상 및 음성 대조군으로 사용 하였다 유한 섬유 모세포 라인상의 ALDH 활동 비색 분석 키트를 사용하여 평가되었다. 이 키트는 450 nm에서 읽기 흡수하여 ALDH 효소 활성을 정량화. 모든 실험은 3 회 반복 수행 하였다. 트립신에 의한 단층에서 세포 배양을 해리 (2.2 절 참조). 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 유세포 분석 유량 : 참고 : 단일 세포 현탁액을 유동 세포 계측법 샘플의 최적의 염색이 필요합니다. 각각의 항체를 시험 할 수 있도록 단일 세포 현탁액을 준비해야한다. 트립신에 의한 단층에서 세포 배양을 해리 (2.2 절 참조). / 1 × 105 세포의 최종 세포 농도의 세포 현탁액을 수득 분리 버퍼의 적절한 체적 챔버를 카운트 BURKER를 이용하여 세포 수, 원심 셀 400 XG에서와 재현 탁을 수행하는 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 배치 ml의. 4 ℃에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 분리 버퍼와 펠렛을 씻는다. 두 번이 단계를 반복합니다. MS에 대한 얼룩 세포C 마커 (즉, CD44, CD105 및 STRO-1) 40. 유동 세포 계수기에 긍정적으로 스테인드 세포 현탁액을 분석합니다. 1 D 내에 표시된 샘플을 분석 할 수 있습니다. 분석 할 때까지 4 ° C에서이 샘플을 품어. RT-PCR 추출 및 RNA의 분리 OS-CSC 추가의 세포 냉동 포장 샘플 1 ml의 용해 시약을 추가 상하 수회 펠릿을 피펫 팅에 의해 튜브에 직접 세포를 용균. 4 ℃에서 1 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 새로운 튜브에 뜨는을 전송 200 μL의 클로로포름을 추가하고 안전하게 튜브를 모자. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들 RT에서 5 분 동안 샘플을 품어. 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 혼합물을 세 가지 단계로 분리한다. RNA를 무색의 상부 수용액상에서 배타적이다. 인 파rticularly주의 만 수상을 제거하고 RNA 분리를 진행하는 새로운 튜브로이 단계를 전송합니다. 수성 상을 포함하는 튜브에 500 μL의 이소프로판올을 추가합니다. 손으로 부드럽게 튜브를 흔들어. 실온에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 주의 : 샘플을 원심 분리 한 결과, 측면에 상기 튜브의 바닥에 겔 펠릿을 형성하는 RNA를 볼 수있다. 하단에있는 RNA의 펠렛을 남겨주의하면서 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 튜브에 1 ㎖의 75 % 에탄올을 추가합니다. 소용돌이 후 몇 초 동안 손으로 튜브와 4 ℃에서 5 분 동안 7,500 XG에서 튜브를 원심 분리기. 에탄올을 취소하고 공기는 RNA 펠렛을 건조. 위아래로 수회 용액을 피펫 팅하여 – (50 μL 10) 펠렛이 건조 할 때의 RNase가없는 물에 RNA 펠렛을 재현 탁. 신체의 체중 측정에 의한 RNA의 수율과 순도를 결정260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 uring. 표준 1 % 아가 로스 겔의 총 RNA의 무결성을 평가합니다. -80 ° C에서 RNA를 저장합니다. 역 폴리머 라제 연쇄 반응 역전사 키트를 이용하여 500 ng의 RNA의 샘플들로부터 첫 번째 가닥 cDNA를 합성. 얼음을 녹여 RNA 샘플 및 RT에서 키트에 필요한 용액을 해동. 제조 업체의 프로토콜 다음 cDNA를 합성하기 위해 진행합니다. 반 정량적 역전사 – 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 24 μL의 최종 반응 부피에서 주형으로서 각 샘플 1 μL의 cDNA를 사용하여 모든 PCR들을 수행한다. Nanog를 10 월 3/4 SOX2 및 CD133 유전자의 증폭을 위해, 표 1에 기재된 프라이머 서열을 사용한다. 에티 디움 브로마이드로 1.8 % 아가로 오스 겔 전기 영동 및 염색하여 RT-PCR 생성물을 분리한다. 자외선 ILLUM 아래의 사진ination.