Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

De fleste nuværende studier af cellebiologi og molekylær biologi er baseret på befolkningstal gennemsnit. Dog kan vigtige biologiske begivenheder blive maskeret af disse traditionelle populationsbaserede analyser, da mindre befolkninger kan spille vigtige roller i biologiske processer og resultater sygdom. Forståelse genekspression i heterogene populationer på enkelt celle niveau kan (og har) føre til relevante biologiske og kliniske indsigt ^1,2. Af bekymring for embryonale udviklingsstudier, i en større population af celler, stamceller er ofte underrepræsenteret, hvilket gør det udfordrende at opdage subtile ændringer i genekspression, som i sidste ende initierer celle skæbne beslutninger ^3. Tilsvarende kan en enkelt celletype have forskellige udtryk profiler i afhængighed af mikromiljøet ^4. For eksempel residente endotelceller i samme organ eller i forskellige organer (f.eks., Aorta eller nyrer) udviser signifikant heterogenitet trods deling fælles MORPhological og funktionelle egenskaber ^5. Desuden kan cancerceller befolker samme tumor også have varierende molekylære profiler eller mutationer på enkelt celle niveau ^6.

I modelsystemer har transcriptomics i enkeltceller med succes identificeret nye cellepopulationer, kendetegnet mellemliggende tilstande, der opstår under celledifferentiering og afslørede differentielle cellulære responser på stimuli ^7,8,9. Sådanne indsigter ville have været maskeret i konventionelle populationsbaserede studier. Zebrafisk embryoner er en uhyre underudnyttet kilde til stamceller, stamfader, og differentiere celler til at udforske spørgsmål om enkelt celle heterogenitet og molekylær regulering af cellulære identiteter under udvikling. Deres yderst stereotype, ex vivo udvikling og nem genetisk manipulation gør dem til et fremragende modelsystem for denne fremgangsmåde ^10,11. Specielt har en væsentlig begrænsning for fortolkning af enkelt celle gene udtryk data er, at pålidelig identifikation af nye mellemliggende celle stater under udvikling kræver meget omhyggelig timing af væv samling ^9. Dette er nødvendigt for at sikre, at heterogenitet mellem opfangede celler repræsenterer heterogenitet inden et væv på et enkelt tidspunkt i stedet for heterogenitet i genekspression præsenteret af aldersbetinget celledifferentiering. Sammenlignet med mus, kan zebrafisk embryo udvikling præcist synkroniseret på et stort antal embryoner ^12. Derudover, med stor kobling størrelser, zebrafisk embryoer kan anvendes som en rigelig kilde til stamceller og progenitorceller.

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til isolering af celler fra zebrafisk embryoner og fange enkeltceller ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt integreret kredsløb mikrofluidik (IFC) chip og autopræp for QRT-PCR-genekspression analyse. Denne protokol kan være hurtigt overføres til enhver high throughput multiplexing analyser, herunder heletranskriptom sekvensering, der giver mere omfattende analyse af cellulær heterogenitet ^13. Det giver også flere fordele til traditionelle genekspression assays. Den enkelt celle isolation protokol giver høj levedygtighed efter FACS, som nedsætter andelen af ​​inficerede celler, der er inkluderet i efterfølgende anvendelser. Ved at bruge en IFC kan indfangede celler direkte observeret at evaluere opsamlingsprocent og vurdere celle sundhed morfologisk. Desuden denne protokol er bredt anvendelig til zebrafisk forskningsverden, som kun kræver en mærket transgene fisk linje og adgang til mikrofluide celle capture teknologi.

Som bevis på princippet blev enkelte celler afledt af hjerte-progenitorer isoleret og fanget på en IFC-chip, og derefter den relative forekomst af hjerte- differentieringsmarkører blev målt ved QRT-PCR. Genekspression analyse på enkelt celle niveau viser, at hjerte-stamfædre sameksistere med deres Forskelntiating afkom. Den indsigt erfaringer fra encellede profilering af hjerte stamfædre kan kaste lys over heterogenitet i genekspression mønstre blandt hjerte-stamceller under hvirveldyr udvikling, som kan være blevet maskeret i traditionelle populationsbaserede analyser.