Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

De flesta av dagens studier av cell- och molekylärbiologi är baserade på medelvärden befolknings. Emellertid kan viktiga biologiska händelser maskeras av dessa traditionella populationsbaserade analyser, eftersom små populationer kan spela viktiga roller i biologiska processer och sjukdomar resultatet. Förstå genuttryck i heterogena populationer vid den enda cellnivå kan (och har) leda till relevanta biologiska och kliniska insikter ^1,2. Berör embryonala utvecklingsstudier, i en större population av celler, stamceller är ofta underrepresenterade, vilket gör det svårt att upptäcka subtila förändringar i genuttryck som slutligen initiativ till beslut cell öde ^3. På liknande sätt kan en enda cell typ har olika expressionsprofiler som svar på mikromiljön ^4. Till exempel, bosatta endotelceller i samma organ eller i olika organ (t ex., Aorta eller njure) uppvisar signifikant heterogenitet trots att dela gemensamma MORPhological och funktionella egenskaper ^5. Dessutom kan cancerceller befolka samma tumör också ha varierande molekyl profiler eller mutationer vid den enda cellnivå ^6.

I modellsystem har transkriptomik i enstaka celler framgångsrikt identifierat nya cellpopulationer, kännetecknad mellantillstånd som uppstår under celldifferentiering, och avslöjade differential cellulära svar på stimuli ^7,8,9. Sådana insikter skulle ha maskerats i konventionella populationsbaserade studier. Zebrafisk embryon är en oerhört underutnyttjade källa stam, stamfader, och differentierande celler för att utforska frågor om en enda cell heterogenitet och molekylär reglering av cellulära identiteter under utveckling. Deras mycket stereotypa, ex vivo utveckling och enkel genetisk manipulation gör dem till en utmärkt modellsystem för detta synsätt ^10,11. Närmare bestämt en stor begränsning för tolkning av en enda cell gene uttryck data är att säker identifiering av nya mellancelltillstånd under utveckling kräver mycket noggrann timing av vävnad samling ^9. Detta är nödvändigt för att säkerställa att heterogenitet mellan infångade cellerna representerar heterogenitet i en vävnad vid en enda tidpunkt snarare än heterogenitet i genuttryck presenteras av åldersberoende celldifferentiering. Jämfört med möss, kan zebrafisk embryoutveckling exakt synkroniseras över ett stort antal embryon ^12. Dessutom, med stora kopplingsstorlekar, zebrafisk embryon kan användas som en rik källa till stam- och stamfaderceller.

Detta protokoll beskriver en metod för att isolera celler från zebrafisk embryon och fånga enskilda celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig integrerad mikrofluidik krets (IFC) chip och autoprep system för QRT-PCR genexpressionsanalys. Detta protokoll kan vara snabbt överföras till någon hög genomströmning multiplexering analyser inklusive helatranskriptom sekvense som tillåter mer omfattande analys av cell heterogenitet ^13. Det finns också flera fördelar för traditionella genuttryck analyser. Den enda cell isolering protokoll ger hög lönsamhet efter FACS, vilket minskar andelen komprometterade celler som ingår i program nedströms. Genom att använda en IFC, kan infångade cellerna observeras direkt för att utvärdera en avskiljningsnivå och bedöma cell hälsa morfologiskt. Dessutom är detta protokoll i stort sett tillämpas på zebrafisk forskarsamhället, som endast kräver en märkt transgen fisk linje och tillgång till mikroflödescell tekniker för avskiljning.

Som bevis på principen, var enskilda celler härledda från hjärt stamceller isoleras och fångas på ett IFC-chip, och sedan den relativa förekomsten av hjärtdifferentieringsmarkörer mättes med QRT-PCR. Genexpressionsanalys vid den enda cellnivå visar att hjärt progenitorceller samexistera med deras differentiating avkomma. Insikten från encelliga profilering av hjärt stamceller kan belysa heterogenitet i genuttryck mönster bland hjärt progenitorceller under ryggrads utveckling, som kan ha maskerats i traditionella populationsbaserade analyser.