Summary

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's

Published: March 12, 2016
doi:

Summary

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Introduction

De meeste huidige studies van de cel- en moleculaire biologie gebaseerd op gemiddelden populatie. Echter, belangrijke biologische gebeurtenissen worden gemaskeerd door deze traditionele bevolking op basis van analyses aangezien kleine populatie grote rol in biologische processen en de ziekte uitkomst kunnen spelen. Inzicht in genexpressie in heterogene populatie in de enkele cel niveau kan (en moet) leiden tot relevante biologische en klinische inzichten 1,2. Van belang voor studies embryonale ontwikkeling, in een grotere populatie van cellen, progenitorcellen vaak ondervertegenwoordigd, waardoor het een uitdaging om subtiele veranderingen in genexpressie die uiteindelijk lot van de cel beslissingen 3 initiëren detecteren. Evenzo kan een enkel celtype verschillende expressieprofielen hebben in reactie op de micro 4. Bijvoorbeeld, woonachtig endotheelcellen in hetzelfde orgaan of in verschillende organen (bijv., Aorta of nier) vertonen aanzienlijke heterogeniteit, ondanks het delen van gemeenschappelijke morphological en functionele kenmerken 5. Bovendien kunnen kankercellen bevolken dezelfde tumor ook variërende moleculaire profielen of mutaties op de enkele cel niveau 6.

In modelsystemen heeft transcriptomics in enkele cellen met succes geïdentificeerd nieuwe cel populaties, gekenmerkt tussenliggende staten die optreden tijdens de celdifferentiatie, en onthulde differentiële cellulaire reacties op stimuli 7,8,9. Dergelijke inzichten zou zijn gemaskeerd in conventionele bevolking op basis van studies. Zebravis embryo's zijn een enorm weinig gebruikte bron van stamcellen, voorlopercellen, en differentiërende cellen voor het verkennen van vragen van enkele cel heterogeniteit en moleculaire regulatie van cellulaire identiteiten tijdens de ontwikkeling. Hun zeer stereotiep, ex vivo ontwikkeling en het gemak van genetische manipulatie maken ze een uitstekend modelsysteem voor deze aanpak 10,11. In het bijzonder, een belangrijke beperking van de interpretatie van enkele cel gene uitdrukking gegevens is dat een betrouwbare identificatie van nieuwe intermediaire cel toestanden tijdens de ontwikkeling vereist zeer zorgvuldige timing van weefsel collectie 9. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de heterogeniteit tussen gevangen cellen vertegenwoordigt heterogeniteit binnen een weefsel op een enkel tijdstip in plaats van heterogeniteit in genexpressie door leeftijdsafhankelijke celdifferentiatie. In vergelijking met muizen kunnen zebravisembryo ontwikkeling nauwkeurig gesynchroniseerd over een groot aantal embryo's 12. Bovendien, met grote clutch formaten zebravisembryo's kunnen worden gebruikt als een rijke bron van stamcellen en progenitorcellen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze om cellen van zebravis embryo's te isoleren en te vangen enkele cellen met behulp van een commercieel verkrijgbare geïntegreerde schakeling microfluidics (IFC) chip en autoprep voor qRT-PCR analyse van genexpressie. Dit protocol kan snel overdraagbaar aan een high throughput multiplexing assays waaronder geheeltranscriptoom sequencing dat meer uitgebreide analyse van de cellulaire heterogeniteit 13 toelaat. Het biedt ook een aantal voordelen aan traditionele genexpressie testen. Ééncellig isolatieprotocol levert hoge levensvatbaarheid na FACS, waar het aantal besmette cellen die zijn opgenomen in stroomafwaartse toepassingen afneemt. Door het gebruik van een IFC, kan gevangen cellen direct worden genomen om vast te leggen tarieven te evalueren en morfologisch beoordelen gezondheid van de cellen. Bovendien, dit protocol is breed toepasbaar op de zebravis onderzoek gemeenschap, is er slechts een label transgene vis lijn en toegang tot microfluïdische cel afvangtechnologieën.

Als bewijs van het principe werden afzonderlijke cellen afkomstig van cardiale progenitors geïsoleerd en vastgelegd op een IFC chip, en vervolgens de relatieve hoeveelheid van cardiale differentiatie merkers werd gemeten met qRT-PCR. Genexpressie analyse op de single cell niveau toont aan dat cardiale voorlopercellen samengaan met hun differentiating nageslacht. Het inzicht verkregen uit eencellige profilering van cardiale voorlopercellen kan licht werpen op de heterogeniteit in genexpressie patronen onder cardiale stamcellen tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren, die kunnen zijn gemaskeerd in de traditionele bevolking op basis van analyses.

Protocol

Dit protocol vereist het gebruik van levende, volwassen zebravissen om embryo's te produceren. De embryo's worden geoogst voor weefsel collectie. Het is essentieel om de goedkeuring van de juiste ethische review boards te verkrijgen om dit experiment uit te voeren. 1. Vraag Geënsceneerde Embryo's De dag voor het experiment, voor te bereiden gezonde, volwassen zebravissen voor de fokkerij. Plaats een mannelijke en een vrouwelijke aan weerszijden van een duidelijke divi…

Representative Results

Als proof of principle, werd genexpressie onderzocht om differentiatie dynamiek te verkennen tijdens de ontwikkeling van het hart. In de zebravis, cardiale voorlopercellen ontstaan ​​uit een mesodermale populatie van cellen die migreren naar de voorste laterale plaat mesoderm waar ze fuseren met de lineaire hart buis te vormen. Voorafgaand aan fusie, cardiale voorlopercellen beginnen de transcriptiefactor Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), waarvan wordt gedacht dat het eerste specifie…

Discussion

De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van expressie van een fluorescerend eiwit onder controle van een cel-type specifieke promotor om een ​​populatie van cardiale progenitorcellen van zebravis embryo's voor gebruik in microfluïdische steungebied eencellige beeldverwerkingssysteem verrijken expressie van een subset van cardiale genen in één evalueren cellen. Mits FACS laser excitatie en emissie vermogen verenigbaar met het fluorofoor (s) naar keuze, kan deze methode worden gebruikt voor elke fluorescer…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Materials

Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 mL GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye – Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

Referências

  1. Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
  2. Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
  3. Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
  4. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
  5. Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
  6. Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
  7. Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
  8. Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
  9. Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
  10. Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
  11. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  13. Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
  14. McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
  15. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
  16. Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
  17. Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
  18. Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
  19. Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
  20. McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
  21. Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
  22. Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
  23. de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
  24. Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
  25. Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
  26. Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).

Play Video

Citar este artigo
Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

View Video