Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
En roman dissektion och inspelning teknik beskrivs för optisk övervakning-färgning och de-färgning av lansettlika terminaler omgivande hårsäckar i huden på musen pinna. Preparatet är enkel och relativt snabb, tillförlitligt ger omfattande regioner av flera märkta enheter av levande nervändar för att studera upptag och utsläpp av styrylfärgämnen pyridinium färgämnen i stor utsträckning används i studier av vesikler återvinning. Uppdelning förberedelserna innan märkning tillåter testet kontra kontrolljämförelser i samma öra från en enskild individ. Användbara tips ges för att förbättra kvaliteten av preparatet, märkning och bildparametrar. Det nya systemet är lämpligt för analys av farmakologiskt och mekaniskt inducerat upptag och frisättning av dessa viktiga färgämnen i lansettlika terminaler i både vildtyp och genetiskt modifierade djur. Exempel på modulerande påverkan på märkning intensitet ges.
Mechanosensory nervändar är vanligtvis små, diffust fördelat och svårtillgängligt på plats, eftersom de vanligen begravda djupt i huden eller andra omgivande vävnader. Visualisera dem därför vanligtvis kräver sektioneringen följt av en långvarig immunomärkning / färgnings period, eller fördröjningen och kostnaden för att erhålla mus linjer med genetiskt uttryck av fluorescerande märkningar, såsom grön eller gul fluorescerande protein (GFP / YFP) 1. Här visar vi en bekväm vävnad och en snabb och enkel metod för att få tillgång till ett stort antal hårsäckar afferenter för studier, och hur de kan snabbt märkas för optisk övervakning av terminalfunktionen 2. Med lite övning kan hela tekniken från dissektion avbildning fyllas i så lite som två timmar.
De lansettlika terminalerna av sensoriska axoner innerverar hårsäckar hos däggdjur bildar palisades runt epitelet av håret-follikelstimulerande, med varjeterminal inklämt mellan gliaceller / Schwann cellprocesser 2-4. Syftet av terminalerna är att detektera mekanisk förflyttning av de hårstrån som de omger. De är en blandning av snabbt och långsamt anpassa ändelser, men de främst producerar korta skurar av aktivitet som svar på håret rörelse. Typiskt stoppar bränning mycket snabbt när rörelsen upphör, även i närvaro av en fortsatt förskjutning.
Denna murina pinna modell för att studera lansettlika terminaler genom optiska metoder har många fördelaktiga särdrag för att studera strukturen och funktionen av dessa avslutningar. Ytterörat är huvudsakligen två lager av hud apposed back-to-back, med endast en liten mängd av broskvävnad mellan. Huden är mycket tunn och lätt dissekeras på grund av minimala mängder av svagt vidhäftande bindväv i förhållande till andra delar av kroppen. De lätt separeras hudlagren därför ge god tillgång till hårsäckarna och terminaler. innervationär lättillgängligt och identifierbar. Hårsäckarna glesare fördelade än i andra hudområden, vilket underlättar avbildning av enskilda eller små grupper av folliklar. Det tunna underliggande dermala skiktet ger god tillgänglighet till färgämnen och farmakologiska läkemedel, så är idealisk för avbildning av fluorescensmikroskopi utan vidare bearbetning. Avbildning av märkta terminaler kan antingen vara levande terminaler eller om du använder en fastställbara dye analog, efter fixering och ytterligare histologisk bearbetning.
Vi har använt denna beredning för att visa att membran återvinning sker i lansettlika ändelser, framgår av upptag (endocytos) och släpp (exocytos) av en styryl pyridinium färgämne (FM1-43 N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid). Färgämnet dock inte tycks avsevärt märka investerar Schwann cellprocesser 2. Vi visade också att denna färgupptagning / release, och därmed membran reCycling, är föremål för glutamaterg modulering genom ett atypiskt (fosfolipas D-kopplad) metabotropiska glutamatreceptorn. Resultaten av enkla stimulerings och analysprotokoll illustreras, och gemensamma potentiella problem analys lyfts också fram.
Bewick och Betz utvecklades ursprungligen N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid relaterade styryl pyridinium färgämnen 7-10 för att övervaka lokala återvinning av synaptiska vesikler membran. Dye upptag, och därmed ökad fluorescens, avspeglar således synaptiska vesikler membran interna (endocytos). Därefter detta intern färgämnet kan återutsättas genom ytterligare elektrisk aktivitet, som visar färgförlust övervakar vesikelmembranet externalisering (exocytos). I synapser, är detta ett mått på signalsubstans sekretion. Samtidigt fann vi även dessa färgämnen märka primära mechanosensory nervändar 7. På senare tid 11, Bewick, banker och kollegor visade sedan att detta återspeglar en liknande process i mogna, differentierade mechanosensory terminaler ex vivo. Här igen, färgämnen märka 50 nm i diameter "synaptiska liknande" vesiklar (SLVS) som återvinner konstitutivt att frigöra glutamat.I mechanosensory terminaler, till skillnad från sina synaptiska motsvarigheter, är denna återvinning främst spontana. Det är också moduleras genom mekanisk, snarare än att bara elektriska, stimulering.
För sensoriska neuroner i kultur och i cochlea hårceller, styrylfärgämnen i allmänhet och styryl pyridinium färgämne i synnerhet har visat sig passera genom mechanosensory kanaler, blockera mechanosensory kanaler och irreversibelt märkning interna membran 12. Men vid jämförbara styryl färgämneskoncentrationer i differentierade mechanosensory terminaler in situ, som här i lansettlika ändelser 2, eller i Ia ändar i muskelspolar 11, och hårceller som inte är mekaniskt stimuleras 13, 14, är märkning av membran endocytos. I mechanosensory nervändar, till exempel, är reversibel märkning och inte blockerar mechanosensory svar på de koncentrationer som används här två, 11, en5. Medan vissa färgämnesinterna genom kanalträngning i dessa ändelser inte helt kan uteslutas, den nästan totala avfärgning med latrotoxin indikerar den stora majoriteten av märkningen i mogna terminaler är av internalisering med återvinning vesikelmembranet. Vi har därför använt denna teknik för att studera aktiviteten beroende 11 och senast farmakologi 2 av SLV återvinning i mechanosensory afferenta terminaler genom att undersöka läkemedelseffekter på upptag och frisättning av färgämnena.
Som med de flesta praktiska tekniker kräver reproducerbarhet upprepning och praktik. Några av de viktigaste punkterna för att säkerställa tillförlitligheten kommer nu att diskuteras. Lansettlika märkning hos yngre djur är mer tillförlitlig – den minsta djur som vi har använt var 15 g kroppsvikt. Det är inte helt klart varför detta är fallet, men det kan bero på dissekering av den yngre bindväv kräver mindre mekanisk trauma och leaves mindre kvarvarande återstoden när du tar bort vävnaderna liggande innervation skiktet.
Totalt sett är det vävnadspreparat ganska enkel, med skalar hudlagren isär är den mest tekniskt utmanande praktisk aspekt och sedan bara hos äldre möss. I dessa hudlagren kraftigt vidhäfta tillsammans vid basen där dissektion börjar, men även här separation av skikten blir mycket lättare mot marginalerna. Tack och lov, eller kanske därför dessa tunnare marginella hudområden brukar ge den mest tillfredsställande märkning, som gör den främre huden i allmänhet. Därför, i synnerhet undvika att ta tag i mycket tunn hud på marginalerna. För att minimera risken för skador, manipulera preparat indirekt genom att trycka med slutna pincett snarare än gripa direkt, eller om detta är viktigt grepp bara hårdare vävnader osannolikt att märkas. Var noggrann i att ta bort "blad polystyren" lagret omedelbart överliggande hårsäckarna, eftersom detta är den viktigaste migmekanisk hinder för bildbehandling och drog tillgång. Emellertid är det viktigt att minimera fysisk kontakt med underliggande strukturer såsom detta skadar (dvs., skalar bort) de neurala nätverk och terminaler bara nedan. Om den dominerande fluorescens är gul / vit i talgkörtlarna, framträdande auto-fluorescens av hårstrået baser och några halvmånar av orange / gul lansettlika ändelser, indikerar detta nervplexus skiktet och tillhörande lansettlika terminaler har avlägsnats under avslut. Detta verkar vara det största problemet med äldre (> 30 g) möss. Under hela färgningsprocedurer, se till att allt är vid 30 ° C och väl syresatt. Var medveten om att märkta terminaler är fortfarande vid liv. Följaktligen kommer färgämne utsöndras av pågående spontan (konstitutiv) exocytisk release. Detta kommer att vara långsammare vid R / T, men det är bra att minimera fördröjningen mellan avlägsnandet av kelator lösning och bildbehandling, för att minimera färgförlust. Dessutom för mellan-grupper jämförande studies intensitet, är det viktigt att se till avbildning av alla grupper är tidsmatchade. Användning av en färg kelatbildare innan avbildning avsevärt förbättrar bildkontrasten. Så medan relativt dyra, är mycket viktigt för att säkerställa god bildkvalitet kelateringen steget. Kelator användning kan minimeras genom att återanvända lösningen flera gånger, och till och med på 2 – 3 dagar i följd, om den förvaras vid 4 ° C mellan användningarna. Släng kelator lösning när det går märkbart rosa, visar dess färgämnesbindning närmar mättnad.
Under avbildning, vara medveten om risken för fototoxisk skada på dessa levande terminaler, som är ett kumulativt resultat av både intensiteten och exponeringstiden för excitationsljuset. Denna synpunkt är mindre viktigt för enstaka tidpunkt bilder, där bildkvaliteten är det primära målet. Det är dock viktigt under upprepad avbildning i kinetiska studier för att minska excitation ljusexponering till ett minimum. Samtidigt utveckla dessa färgämnen tilletikett synapser, fann vi excitation för> 1 min vid full effekt exciteringsbelysning kommer att orsaka dramatiska och irreparabel skada på nervterminaler. De först därefter expandera enormt, sedan kollapsa helt över en period av ~ 15 min. Vi har inte systematiskt testa de relativa bidragen från exponeringstid och intensitet, men dessa observationer tyder på den vägledande principen bör vara att minimera båda. Så, är det rekommenderat att excitationsljus intensitet och varaktighet är den minsta i proportion med att få bra bilder, och lämpliga kontroll bilder tas i tidsförloppet studier. För att testa att uppgifterna inte påverkas av fototoxicitet under upprepade avbildningsbetingelser, vid varje tidpunkt ta en extra bild av en tidigare inte visats terminal. Detta är att se till att beteendet hos märkning naiva terminaler liknar den i hårsäckarna som avbildas flera gånger.
Ett antal faktorer kan reducera variabiliteten av nettointensiteten d inomgruppsata. Exakt placering av ROI, särskilt bakgrunden ROI, är viktigt, eftersom även små områden av olämplig färgning i hög grad kan påverka mellan-follikelstimulerande uppgifter variabilitet. Variationen i netto intensitet påverkas också av hur fullständigt varje hårsäck är omgivet av palissad av ändelser. Jämför exempelvis halvmåneformade distributions märkning i figur 1B med nästan helt cirkulärt mönster ses i figur 2. Mer komplex analys, kanske med hjälp av automatiserade program upptäckt och tröskel är nödvändiga om graden av inringning är en viktig parameter. Observera att intensitetsfördelningarna för även de mest noggrant analyserade follikelstimulerande grupper som inte normalt fördelade (se figur 3), vilket nödvändiggör användningen av icke-parametrisk statistik för mellan-behandling jämförelser av befolknings medianer snarare än medel. Normaliseringstekniker, såsom att uttrycka intensiteter i procent of kontralaterala kontroll, eller hos en kontrollgrupp består av flera preparat, kan tillämpas för att ytterligare minska variabilitet. Den slutliga tekniska objekt som ska beaktas är den experimentella designen för farmakologisk testning. Under farmakologiska undersökningar, pre-inkubera preparatet i läkemedelslösningen under 30 minuter före färg ansökan. Då, bibehålla läkemedelskoncentrationen i färgämneslösningen. I kontroller, använda antingen saltlösning eller, om läkemedlet är upplöst i ett fordon, saltlösning plus fordon.
Denna artikel visar hur denna nya pinna förberedelse erbjuder högkvalitativa bilder av mechanosensory ändelser kvalitet i huden med minimal förberedelse. Vi visar också att det kan användas för att undersöka farmakologin av två kritiska aspekter av vesikler återvinning. Vi visar först att en glutamatreceptoragonist kan öka färginterna (en markör för endocytos), och andra, är att färgämnet förlorade igen med latrotoxin (ett stimulerande av exocytos). Betydelsen av denna Förberedelsejon och teknik är att det erbjuder utmärkt tillgång till levande hud mechanosenory terminaler på plats för avbildning experiment ger unika möjligheter för optisk övervakning av terminal funktion, struktur och deras inbördes relationer. För detta senare ändamål har vi också utvecklat den vidare för användning i kombinerade optiska / elektrofysiologiska studier (se syster JUPITER artikeln för detaljer).
The authors have nothing to disclose.
Arbetet har finansierats av brittiska Medical Research Council projektbidrag G0601253 till GSB och RWB och en SULSA Bioskape bidrag till GSB
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |