複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

動物を対象とする手順はRegierungspraesidiumテュービンゲン、バーデン=ヴュルテンベルク州、ドイツ、州によっておよびオーストリアの動物実験倫理委員会によって承認され、研究における動物の使用に関するEU指令に従ったされています。 AAV-Channelrhodopsin2-YFPの1定位注射注：定位注射は、以前に公開されたプロトコール20に従って実施しました。 1.5時間180ºCでそれらを加熱することにより、滅菌のツールを準備します。 次のパラメータで設定し、水平微小電極プラーを使用して、注射用の鋭い（〜50μmの直径）ガラスピペットを引き出し：熱=ランプ値を – 20、= 200 = 0、ベロシティ= 100、時間= 200、圧力を引き出します。 注：ランプ値は、マイクロピペットプラーの製造元の指示に従って、購入したガラスピペットのロットごとに決定する必要があります。 ウイルス溶液と滅菌リン酸緩衝生理食塩水（; 25mMの、0.9％のNaCl、pH7.4のPBS）中の（ガラスピペット内の溶液の優れた視認性のための）0.1％ファーストグリーン液0.2μlにプレミックス1μlの。 10μlのピペットとゲルフィルのヒントを使用して、ガラスピペットを埋めます。ウイルス構築物については、のrAAV-HSYN-のChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）を使用します。 小動物麻酔装置（誘導のための酸素の3％イソフルラン）を使用して、マウスを麻酔。つかいます。この研究のために、〜6週齢3野生型マウスを使用します。 耳と目の間に頭を剃るとポビドンヨードベースの溶液で消毒します。 麻酔中に目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。皮下鎮痛剤でマウスを注入（メロキシカムベースの5mg / ml溶液を0.1ml）。 定位フレームにマウスを置き、ガス麻酔器（メンテナンスのための酸素中2％イソフルラン）を介して麻酔を維持します。四肢の撤退の欠如によって麻酔深度をチェック続行する前にレフ。 全体の外科手術中に可能な限り最高の滅菌状態を維持します。使い捨てフェイスマスク、手術用ガウンと手袋を着用してください。 はさみ20を使用して、頭の上に約1cmの皮膚切開を行います。静かにH 2 O 2と頭蓋骨表面ときれいな頭蓋骨を露出するようにクランプで固定し、鈍鉗子を使用して、側に皮膚を引っ張ります。 先端の細い永久的なマーカーを使用して頭蓋骨上のマーク注射部位。マークされたサイトで頭蓋骨に小さな穴（直径約1ミリメートル）を開けます。ブレグマからさ（mm）：3.0後方、1.8±横、3.8腹側このスタッドで一方的なPIN / MGNの注射のために、次の座標を使用します。 マウントは、圧力注入装置に接続された定位固定フレームにガラスピペットを充填し、位置をブレグマピペットをもたらします。 微細なストレートチップピンセットを用いてガラスピペットの先端を折り。 applyinによりピペットチップが開いていることを確認しますGAいくつかの圧力パルスとウイルス液の液滴の押し出しを観察します。 目標噴射座標に移動し、圧力噴射装置で次の設定を使用してピペットコンテンツ（〜0.5マイクロリットル）の半分を注入：圧力20psiで、平均パルス長さ30ミリ秒、パルス50の平均数。 それを後退ゆっくり（1ミリメートル/分）の前〜1分間の場所にピペットを残します。 PBSでクリーン頭蓋骨（pHは7.4）とクランプを取り外します。優しく一緒に皮膚を引っ張って、切開縫合（3から4ノット）。傷の周りに消毒剤（ベースポビドンヨード）を適用します。 麻酔を停止し、完全に目を覚ましまで無人マウスを放置しないでください。シングル収容されたマウスを保管してください。術後、健康状態を監視し続けます。必要に応じた管理者の鎮痛剤。 ウイルス発現の適切なレベルを確保するために、脳の固定の前に4週間のために動物を保管してください。 2.試料の調製 脳固定</強いです> 固定液の調製 固定剤の1 Lの場合、パラホルムアルデヒドの10グラムの重量を量る、脱イオンH 2 Oの300ミリリットルに追加連続的に攪拌しながら10分〜60ºC – 55ヒート。 熱を切り、7追加 – 4 N NaOHを8滴を。解決策は〜10分で明らかになるであろう。 ピクリン酸の飽和溶液の150ミリリットルを追加し、それを室温に冷却してみましょうし、脱イオンH 2 Oで500ミリリットルにそれを持って来ます 0.2 Mリン酸緩衝液（PB）の500ミリリットルを追加します。濾紙でフィルタリングします。 NaOHでpHを7.4に調整します。 6ºCに固定液を冷却し、6ºCで1日以上ないために暗いガラス瓶に保存します。 経心臓灌流 チオペンタール（120 mg / kg体重）の腹腔内注射でマウスを麻酔。動物が深くペダル離脱REFLをチェックすることによって麻酔されていることを確認し不在であるべき元、。縛ら四肢で灌流テーブルの上にその背中に動物を置きます。 平滑末端はさみで縦方向に腹壁を開き、ダイヤフラムが露出するように、横方向に胸郭の尾側の国境に沿って2つの追加のカットを行います。ダイアフラムを離れてカットし、両側のosteocartilageneous国境で胸壁を切りました。心臓を露出するために胸骨を含む胸壁の中央スラブの尾の端を持ち上げます。 灌流装置のカニューレを認めざるを左心室の先端に小さな正確なカットを行い、心膜を削除します。 0.6mmの内径と鈍いカニューレを使用してください。先端が上行大動脈に表示されるまで、心室を通して穏やかにカニューレをパスし、クランプでカニューレを固定します。血液と灌流液が血流を終了できるようにするには、右心房内のカットを行います。 流量で、蠕動ポンプを使用して経マウスを灌流7分間氷冷固定液に続いて約1分間PBSで最初に5ミリリットル/分（25 mMの、0.9％のNaCl、pH7.4）で、の。 固定後、ハサミでマウスの頭部を切断した後、首から鼻に正中線を通って皮膚をカット。完全に頭蓋骨を露出させるために筋肉を削除します。 鋭いハサミを使用して、後頭部と大後頭孔から始まる壁間の骨を通る長手方向のカットを行います。細かいピンセットを使用すると、全体小脳を露出するためにこれらの骨を取り除きます。その後、鼻骨まで頭頂と前頭骨を介して他の長手方向のカットをすると脳全体を露出するようにピンセットでそれらを削除します。 へらを使用すると、それを損傷することなく、脳を取り出し、氷冷した0.1 M PBに配置します。 セクショニングと標本のトリミング 関心のある領域を含むかみそりの刃を持つ6ミリメートル – 約5の冠状ブロックをカット。のホルダーにそれをのりシアノアクリレート系接着剤でvibroslicer。新皮質は、振動翼を向くように組織ブロックを向けます。氷冷0.1 M PB中vibroslicer（ 図1A）と140ミクロンで扁桃体を含むスライスの冠状切片、、、、同じ緩衝液中で6ウェル皿にそれらを収集。 実体顕微鏡下では、関心領域をトリムスライスから（ここでは、ITCの内外背paracapsularクラスタは、 図1Bを参照してください）。眼科用メスを用いて、シリコーンエラストマーで被覆し、0.1 M PBで満たされたペトリ皿にこれを行います。トリミングされたブロックは、スペーサ（約1.5ミリメートル）（ 図1B）の穴に収まることを確認します。 6ºCで凍結保護溶液（0.1 M PB中の30％グリセロール）O / Nにトリミングされたブロックを移動します。 3.高圧凍結注：FRILは6重要なステップで構成されています（ 図2）：高圧（2300で1）急速凍結 – 試料の2600バール）。試料の2）破砕。原形質（P-面）に隣接している半分と外またはexoplasmicスペースに隣接している半分（E-：破断面は、一般的に2つの半膜リーフレットにそれらを分割、凍結した膜の中心疎水性コアを以下の面）。 3）白金及び炭素の真空蒸着法により試料の複製を。組織の4）洗剤消化。 5）イムノゴールドラベリング。透過型電子顕微鏡を用いてレプリカ6）分析。 銅担体の調製 注：FRIL手順の連続段階を経て処理される、検体は、金属（金または銅）キャリアに装着する必要があります。これらのキャリアは、破砕し、中古機械の種類のモードに応じてサイズやデザインに変わります。ここでは、銅のキャリア（ 図1B、E）とヒンジ付き「ダブルレプリカ表」を使用しました;開いたときには、凍結標本（ 図2）を介して引っ張り破断を生成する、（ 図3B参照）。これは、骨折した試験片の両側を保持し、複製することを可能にします。 セーム皮のシートを使用して変色除去とポーランドの銅キャリア。 ガラスポットとクリーンに入れキャリア二回超音波処理水浴中の非イオン性界面活性剤（pH約1.5）とは、その後広範囲に脱イオン水、続いて水道水で洗った後、エタノールで二回すすいでください。 15分間アセトン中の銅キャリアを超音波処理します。 乾燥するために濾紙上にキャリアを置きます。 トリミングされたブロック（キャリアを保持する）のためによく保持となる銅キャリア（ 図1C）に両面テープのリングを取り付けます。 検体の凍結 注：注意して液体窒素を処理し、適切なゴーグルを身に着けています。 無料の高圧をオンにします熱意ユニット（ 図1F）、検体の凍結始まる前に少なくとも1.5時間。 「風ヒーター」ボタンを押して、加熱を開始し、50分間ベークアウト。 80℃まで気温を設定します。 高圧冷凍ユニットへの窒素タンクを接続し、液体窒素で内部デュワーを埋めるために「窒素」ボタンを押してください。 「窒素LEVEL」ランプが点灯します。 「冷却」ボタンを押すことで冷却を開始します。 「窒素濃度が「出て行くときにボタン "IN DRIVE」を押してください。油圧システムは、前後に3回ピストンを動かしていることを確認してください。 「AUTO」ボタンを押すと、「窒素」ボタンを押してください。すぐに "READY"が点灯として、高圧冷凍ユニットは、高圧凍結の準備ができています。 AGに溶融した白金線のループを使用して両面テープ（ 図1B）の穴にトリミングされたブロックを配置小娘ピペット。 ろ紙やブラシを使用して、凍結保護剤過剰の溶液を除去します。 注：この手順は、組織の周りに形成してもよいし、組織の形状および/または超微細構造の歪みを引き起こす可能性がある気泡を除去することも重要です。 組織ブロックは、2つのキャリアの間に挟まれるように、実体顕微鏡下では、他のキャリアとキャリア保持をカバーしています。 高圧冷凍ユニット（ 図1D）の試料ホルダーへのキャリアサンドイッチを挿入します。高圧冷凍ユニットに試料ホルダーを挿入します（先端を下）と試料ホルダーにねじ込んで固定します。 「ジェット・オート」ボタンを押して、冷凍サイクルを開始します。可能な限り迅速に作業を、試料ホルダーを削除して、絶縁された箱の中に液体窒素で先端を沈めます。それらを冷却するために液体窒素中で鉗子の二対の先端を浸します。 慎重に目を削除します試料ホルダーから電子キャリアサンドイッチと予め冷却クライオバイアルに入れてください。キャリアが唯一の液体窒素で冷却されたピンセットで扱われていることを確認します。クライオバイアルは、窒素がバイアル（ 図1G）から流出できるようにするために穿孔されるべきです。 すべての希望するサンプルが凍結されるまで繰り返して、3.2.11に3.2.6を繰り返します。サンプルの同じタイプを含む複数のキャリアのサンドイッチは、同じバイアル中で保存することができます。 レプリケーション（ 図1H）までcryotankのキャリアを含むクライオバイアルに保管してください。 図1.組織調製し、高圧凍結。（A）Vibroslicerはセクションに組織を使用。   （B）扁桃体を含む得られた冠状マウス脳切片は、交流と並んで示されopperキャリアは、両面テープのリングを装備します。破線のボックスには、ITCの内側paracapsularクラスタが含まれている関心のある領域を示しています。両面テープの穴の直径は約1.5mmです。 （C）銅キャリアの製造のためのツール。両面テープ、ピンセット、パンチャー、銅キャリア、およびはさみ：時計回りで左上から。 （D）高圧凍結用試料ホルダーへのキャリアサンドイッチの挿入。キャリアサンドイッチは試料ホルダの穴の中に配置されます。 （E）銅キャリア両面テープのリングと「キャリア・サンドイッチ」なしとしています。   （F）加圧タンクがそれに液体窒素を供給するとともに高圧冷凍ユニット。 （G）凍結組織をストックするクリオバイアル。窒素ガスをバイアル（矢じり）から流出することを可能にバイアルの上部中央位置の穴に注意してください。 <st栄>（H）Cryotankは凍結組織を保存するため。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 4.フリーズフラクチャーおよびレプリケーション 電子ビーム銃の調製 電子ビーム銃を挿入する前に、「偏向板」でシールドを取り外します。下カソードカバーを介してコレットチャックにフィラメントをセンタリングするための「設定ゲージ」を配置します。 注：小径端白金銃のためのものであるのに対し、設定ゲージの大径側端部は、カーボンガンのために使用されます。 「圧力ラミナ」まで、ゲージの上に新しいフィラメントをスライドさせてフィラメントコイルが角度で位置していないことを確認して、フィラメントの両端をクランプすることができます。 設定ゲージを取り外し、炭素棒を挿入します。共締めてそれを修正します蒸発器ロッドホルダーのlletチャック、ロッドの端部の高さは下から2番目のコイルの中央にあることを確実にします。プラチナ銃の場合、プラチナロッドの端部の高さは、上から第2フィラメントコイルの中央にあるべきです。 偏向板を交換し、凍結破砕ユニットに銃を挿入します。使用後砂ブラスターと銃をきれいにしてください。 図FRIL技術の重要なステップの2.イラスト。 レプリカの調製および分析のために必要なさまざまな手順の概要。 （1）組織の高圧凍結を。 （2）破砕。凍結組織の破壊時に、原形質膜の脂質二重層は、疎水性界面に二等分に分割されます。原形質膜中のタンパク質はexoplasmic（E-面）またはプロトのいずれかに割り当てられています形質膜（P-顔）。 （3）レプリケーション。炭素（C）の蒸発は、骨折、組織の表面上に、脂質及びタンパク質を捕捉します。材料は、60°の角度でシャドーイングのために2 nmの白金/炭素でコーティングされ、その後、レプリカ（C-層、白金 – シャドウイング）の構造を強化する別の15 nmの炭素層とされています。 （4）可溶化。レプリカ膜に捕捉されていない組織は、その後、SDS溶液で可溶化します。 （5）ラベリング。目的のタンパク質は、特異的一次抗体（一次抗体）及び金粒子（金）とコンジュゲート二次抗体（二次抗体）からなる複合体を使用して、レプリカ上で可視化することができます。金粒子の異なるサイズの使用は、同じレプリカで複数のタンパク質の検出を可能にします。 （6）免疫標識した後、複製は、銅メッシュグリッド上に収集され、80での透過型電子顕微鏡で分析- 100 kVのCLICくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。 凍結破砕装置のセットアップ 凍結破砕および複製手順の詳細については1に主電源を回すことにより凍結破砕装置（ 図3A）のスイッチをオンにし、メーカーが提供する取扱説明書を参照してください。 凍結破砕装置を冷却する前に、暖かい空気とのユニットの冷却システム全体を焼きます。プレスMTC 010デバイス（温度制御ユニット）（ 図3A）の「解凍」ボタンと45分間ベークアウト処理の実行をしてみましょう。 真空ステーションを有効にします。 10 -7ミリバール-凍結骨折部は通常、約10 -6の真空範囲で動作します。 窒素タンクを記入し、凍結破砕ユニットに接続します。バルブホルダが乾燥していることを確認し、また、バルブホルダの挿入前タンクのエントリをきれいに（湿度がvacuuに干渉することができますタンクのN 2充填のメートルと表示）。 ℃〜-115に温度を設定することにより、冷却を開始します。冷却は約45分かかります。 電子ビーム銃を挿入し、蒸発させるための次のパラメータに到達するために電流と電圧を調整します。 カーボン銃：上の回転、位置90°、炭素蓄積の率0.1から0.2ナノメートル/秒炭素 – 白金銃：オフの回転、位置60°、蓄積0.06のレート – 0.1ナノメートル/秒注：ガンは、炭素または白金棒の交換後に初めて使用された場合、使用する前に、3分間脱気。 破砕およびレプリケーション すべての操作は、液体窒素中で行われていることを確認することの二重のレプリカテーブルに凍結されたキャリア・サンドイッチを挿入します。 デュワー瓶に二重のレプリカ表を移し、45°の角度で試料ステージの受信機にそれを修正。液体窒素レベルは常に二重レプリカテーブルの上でなければなりません。 </李> テーブルマニピュレータとの二重のレプリカテーブルをピックアップし、コールドステージ上に凍結破砕ユニットに挿入します。ダブルレプリカ表の温度は-115℃に調整できるようにするために約20分を待ちます。 真空は10 -6ミリバール未満であり、温度は-115℃であることを確認してください。 ダブルレプリカテーブルの上に置いシュラウドに接続されたホイールの手動反時計回りの回転によって組織を骨折。シュラウドが回転すると、それは、組織を破砕、開くにはダブルレプリカ表を強制します。 凍結破砕装置（ 図3A）のEVM 030デバイス（電子ビーム蒸着制御ユニット）の「ハイテンション」ボタンを押してください。 一方向SHADO続いて、5nmの厚さに対して90°の角度で位置する電子ビーム銃による炭素（回転）を蒸 ​​発させることにより破砕組織（ 図3C）の露出表面を複製2nmの厚さに60°の角度で白金炭素と翼。最後に、90°の角度（回転）から炭素の15 nmの厚さの層を適用します。 蒸発させるための次のパラメータを使用します。 第一炭素：上の回転、位置90°;スピード0.1から0.2ナノメートル/秒。 5 nmの第二炭素 – 白金：位置60°;スピード0.06から0.1 nmの/秒。 2 nmの第三炭素：上の回転、位置90°;スピード0.3から0.5ナノメートル/秒。 15 nmの （トリス、pHが7.4を緩衝食塩水）凍結破壊ユニットから複製標本を削除し、セラミック12ウェルプレートTBSで満たされた（ 図4A）に転送します。 白金耳の線材を使用して、試料キャリア（ 図4A）から複製された組織を除去します。 すべてのサンプルが複製されるまで繰り返して、4.3.10に4.3.1を繰り返します。 <b r /> 図3.凍結破砕およびレプリケーション。 （A）凍結破砕装置。マシンはいくつかのコントロールユニットとモニターが含まれています。試験片は、チャンバの左側のポートを介してチャンバ内に導入されます。加圧された液体窒素の容器は、ステージを冷却するために凍結破砕ユニットに接続されています。ショー拡大単位（UPC 010とMDC 010）のうちの2つのビューと第2の炭素層の蒸発時にパラメータを表示するモニター下の画像。   （B）がオープン（左）と二重レプリカ表の（右）ビューを閉じました。 「キャリアサンドイッチ "は（矢印で示す）は、テーブルのスロットに挿入されています。小型武器は、操作中に脱落から「キャリア・サンドイッチ」を防ぎます。 （C）骨折とレプリケートサンプル。レプリカは、骨折した組織の上に薄く黒いフィルムが表示されます。53 / 53853fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 レプリカのSDS-消化 SDS-消化緩衝液（2.5％ラウリル硫酸ナトリウム、15 mMトリス、pHが8.3で20％ショ糖）の1mlで満たさを4mlガラスバイアルに移しレプリカ。 （45ストローク/分）を振盪しながら80℃で18時間ダイジェスト。 RTでSDS-消化緩衝液や店舗で満たされた新しいチューブにレプリカを転送します。 5.免疫標識注：すべてのインキュベーションは、抗体とのインキュベーションを除いて、穏やかに振とうしながら室温で行われています。 新鮮なSDS-消化緩衝液中で10分間のレプリカを洗ってください。 TBS中の2.5 5分間TBS中の％のBSA（ウシ血清アルブミン）、その後3×10分間0.1で％BSAで一度複製を洗います。 1時間、5％BSAを含むTBS中の非特異的結合部位をブロックします。 一次抗を適用します体は、2％BSA-TBSで希釈しました。 72時間15°C（ 図4C）で湿潤チャンバー内30μlの低下（ 図4B）でインキュベーションを行います。 この研究のために骨折した組織から、プロセスの両方のレプリカを。アミノ酸660をカバーする組換え融合タンパク質に対して惹起またはマウスモノクローナル抗体（200：1希釈）すべてのAMPA-Rサブユニットに共通のマウスのGluR1の754 – アミノ酸717に対して惹起モルモットポリクローナル抗体で1レプリカをインキュベート – NMDA-RのNR1サブユニットの811（希釈1：500）、および緑色蛍光タンパク質に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体（希釈1：300）。 （1：500希釈）ラットμオピオイド受容体の398 – 酸384アミノ酸に対応する合成ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を用いて他のレプリカをインキュベートします。 0.05％BSAを含むTBS中で洗浄（3×5分）。 二次抗体を適用します。この研究のuのためにSE金の2％BSAを含むTBSで希釈したコンジュゲート抗体（イオンチャネル型グルタミン酸受容体、μオピオイド受容体に対する10および/またはにChR2-YFPのための15 nmのための5 nm）を。二次抗体を1:30希釈し、15℃のCO / Nで30μlのドロップでインキュベートします。 RTで0.05％BSA-TBSで3×5分間洗浄します。 超純水で2×5分間洗浄します。 ホルムバールコーティングされた100行の並列バーグリッド（ 図4D）のマウントレプリカ。 6.レプリカ解析 80または100キロボルトでの透過型電子顕微鏡（TEM）による像のレプリカ。 CCD（電荷結合素子）カメラを介してデジタル画像を取得します。 オフラインでは、ランドマークを使用して、両方のレプリカ（ 図4E）からの画像に対応する領域を見つけます。 J.は、シナプス後領域と分析受容体に対する免疫金標識粒子の数を決定するイメージを使用してデジタル画像を分析します。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページ= "1"> 図4.レプリカの免疫標識。 （A）のレプリカを操作し、洗浄するためのツール。セラミック12ウェルプレート（右上）とガラスピペットの2種類（左上）。丸い先端（左下）を有するガラスピペットは、レプリカを転送するために使用され、白金ロッド（下部中央）を有するピペットはレプリカを展開するために使用されます。洗浄緩衝液中のレプリカ（右下）。レプリカの（B）免疫標識は、組織培養6ウェルプレートのウェルにパラフィルムの小片上に配置された小滴（30μL）中で行われます。レプリカは、抗体を含む緩衝液滴で覆われていることに注意してください。蒸発を防ぐために、ティッシュペーパーの湿潤部分はウェルの内縁の周囲に取り付けられています。 （C）免疫標識ステップのためのインキュベーター。インキュベーションは15℃で行われます。 （D）ホルムバール被覆に搭載されたレプリカ100-ライン並列バーグリッド。 （E）のレプリカのペアから低倍率の顕微鏡写真。点線の四角は、対応するレプリカ内の位置を特定するために3つの代表的なランドマークを示しています。スケールバー：10μmです。すべてのデータが示されている平均値±SEM 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。