Summary

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Published: March 25, 2016
doi:

Summary

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Abstract

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introduction

Врожденные иммунные клетки представляют собой существенную часть клеток внутри опухоли микроокружения и были связаны с злокачественности опухоли у пациентов , так и на животных моделях рака 1. В последнее время она стала более широкое признание , что хронические иммунные реакции играют важную роль в продвижении прогрессии опухоли, метастазирование и устойчивость к химиотерапиях 2. Макрофаги являются важными врожденные иммунные клетки , которые были показаны непосредственно регулируют реакцию опухолевых клеток к химиотерапии 3,4. Тем не менее, роль нейтрофилов, ключевых игроков врожденной иммунной системы, в регуляции ответа опухоли на лечение противораковым не известно. Цели этих протоколов использовать быстрый и надежного метода для разделения нейтрофилов из образцов крови ХЛЛ пациента и дифференцировать HL60 клетки вдоль гранулоцитарного пути для того, чтобы изучить их роль в регуляции чувствительности клеток лимфомы к анти-лимфомой агентов.

<p class= "jove_content"> Нейтрофилы являются наиболее распространенными клеточный компонент врожденной иммунной системы в крови 5 и действовать в качестве первой линии обороны против вторжения микроорганизмов 6. Нейтрофилы играют существенную роль в повышении эффективной врожденной иммунной реакции в дополнение к переменной эффекторных функций в ряде патологических состояний 7. Таким образом, быстрый и надежным способом изолировать нейтрофилы от других клеток крови, таких как метод разделения градиента плотности, необходим для исследований в лабораторных условиях . При использовании этого метода для выделения нейтрофилов будет способствовать дальнейшим исследованиям по нейтрофильных опосредованной иммунологических функций в естественных условиях и бывших естественных условиях.

Возможность получения чистых популяций нейтрофилов является важным первым шагом для исследования пациентов с иммунологическими заболеваниями 8. Плотность градиентный метод разделения является идеальным метод, в котором получают высокий выход клеток. метоd включает добавление градиента плотности раствора в нижней части трубки, содержащей разбавленную кровь человека с последующим центрифугированием при 300 г в течение 35 мин без перерыва. Кольцо из мононуклеарных клеток появляется в интерфейсе и нейтрофилы располагаются ниже первого. Этот метод имеет существенные преимущества по сравнению с другими доступными методами , такими как нейтрофильные комплекты изоляции , которые значительно дороже 9. Кроме того, изолирующий нейтрофилы из крови человека с помощью коммерческих наборов с использованием антител, направленных к поверхностным маркером, специфичного для нейтрофилов человека, увеличивает риск активации или дифференциации клеток. Плотность градиентный метод разделения позволяет выделение нейтрофилами в течение короткого периода времени. В течение той же стадии, одноядерные клетки также отделяют и извлекают. Это фундаментальный метод, в котором высокий выход чистого клеток получается для достижения функциональной целостности.

Для того, чтобы имитировать microenv опухолиironment, были выполнены эксперименты 3D. Учитывая короткий период полураспада нейтрофилов в пробирке, 3D – эксперименты со свежими нейтрофилах человека не являются окончательными. По этой причине, промиелоцитарного (HL60) клетки дифференцироваться в нейтрофилами как клетки с использованием дифференциацией индукторов диметилсульфоксид (ДМСО) и ретиноевой кислоты (RA). Использование дифференцированных HL60 клеток (HL60 Diff) предотвратит имеющих различные реакции нейтрофилов из – за изоляции от различных доноров.

В пробирке 3D модели культуры представляют собой промежуточную стадию между ин витро 2D моделей и в естественных условиях модели. В 2D-культуре, клетки распространяются на пластиковой поверхности, образуя неестественные вложения клеток на депонированные белки, которые денатурируют на этой синтетической поверхности. И наоборот, клетки в форме 3D культуры вложений естественной межклеточных Поскольку клетки и внеклеточного матрикса, они синтезируют являются природным материалом, к которому они присоединены.По этой причине модели 3D совместно культуры, особенно между раковыми клетками и другими типами клеток, которые были очень полезны для индикации их вклад в рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. В результате, 3D культуры делают культуру клеток имитировать физиологические условия , которые существуют в естественных условиях 10.

Protocol

1. Выделение и Нейтрофильная Совместное культивирование с первичными лейкозных клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры проводились с одобрения комитета по этике больницы Lyon со всеми пациентами, подписывающих информированное согласие. Выделение первичных лейкозных кл?…

Representative Results

Плотность градиентный метод разделения , описанный здесь обеспечивает первичные лейкозных клеток и нестимулированных нейтрофилы , выделенные из крови пациентов с ХЛЛ Фигура 1А представляет различные слои крови , полученные после центрифугирования в градие?…

Discussion

Описанная здесь, эффективный, простой, быстрый и недорогой протокол для выделения нейтрофилов из крови человека с высокой степенью чистоты с использованием центрифугирование в градиенте плотности подход и в пределах той же стадии мононуклеарных клеток также отделяют и извлекают. Поп…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

Materials

RPMI 1640  Gibco Invitrogen 21875-034
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) Gibco Invitrogen 14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) Life technologies 25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep) Life technologies 15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)  CliniSciences A3001
Vincristine  EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix  BD Biosciences 354234 Put at 4 oC overnight before the day of the experiment
Red cell lysis buffer  BD Biosciences 555899
Ficoll (Pancoll) PAN Biotech P04-60500
Dextran  Sigma-Aldrich D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Sodium chloride (NaCl) Euromedex S3014
Annexing V-FLOUS staining kit  Roche 11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit Cosmos Biomedical CB361550-0000
LSRII flow cytometry BD Biosciences
Cytocentrifuge Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter Nexcelom  Bioscience

Referências

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
check_url/pt/53846?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (109), e53846, doi:10.3791/53846 (2016).

View Video