בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים
Summary
Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.
Abstract
Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.
Introduction
תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה.
<p class= "jove_content"> נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo.היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית.
על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים.
ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות.
שיטות קיימות מספ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).
Materials
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
Referências
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
