Vi beskriver ett kromogent hela montera förfarande multi-målet in situ hybridisering (MC-WISH) i intakta Drosophila embryon som möjliggör simultan och specifikt påvisande av tre olika mRNA fördelningsmönster genom att kontrastera färg fällningar.
För att analysera genreglerande nätverk aktiva under fosterutvecklingen och organogenesen är det viktigt att exakt definiera hur olika gener uttrycks i den fysiska förhållande till varandra in situ. Multi-mål kromogena hela montera in situ hybridisering (MC-WISH) avsevärt underlättar omedelbar jämförelse av genexpressionsmönster, eftersom den tillåter särskiljande visualisering av olika mRNA i kontrasterande färger i samma prov prov. Detta ger möjlighet att relatera genuttryck domäner topografiskt varandra med hög noggrannhet och att definiera unika och överlappande uttrycks webbplatser. I den presenterade protokollet beskriver vi en MC-WISH-förfarande för att jämföra mRNA-uttrycksmönster av olika gener i Drosophila embryon. Upp till tre RNA-prober, varje specifik för en annan gen och märkt med en annan hapten, är samtidigt hybridiserad till embryoproverna och därefter detekteras med alkaline fosfatas-baserade kolorimetriska immunohistokemi. Det beskrivna förfarandet är detaljerad för Drosophila här, men fungerar lika bra med zebrafisk embryon.
In situ hybridisering (ISH) är standardmetoden för detektering och lokalisering av RNA-transkript i en morfologisk sammanhang inom celler, vävnader och organismer 1. De signaler som alstras av ISH förfarandet vanligen visualiseras med radioaktiva, fluorescerande och kromogena detekteringssystem. Under senare år har betydande tekniska framsteg inom fluorescerande ISH (FISK) 2 resulterade i dramatiskt förbättrad känslighet och upplösning, vilket gör detektering och kvantifiering av RNA uttryck vid encelliga och sub-cellulära nivåer och RNA visualisering upp till enstaka molekyler 3,4 .While sofistikerade enda molekyl FISH metoder används för mer specialiserade applikationer, är kromogent ISH utbredd som en rutinmässig RNA in situ detektionsmetoden i forskning och klinisk diagnostik. För kromogent detektering enzym utfällningsreaktioner används, som genererar synliga produkter i kontrasterande färger på platsernaav hybridisering 5. Detta har fördelen att RNA visualisering kan kombineras med rutin histologiska fläckar och morfologisk sammanhanget är omedelbart framgår av standard bright mikroskopi. Dessutom, många av de tillämpade färgsubstrat producerar fällningar, som är stabila i organiska och / eller vatten montering media, så att permanenta preparat prov kan erhållas 5.
I Drosophila, första ISH-protokoll tillämpas radioisotopmärkta prober för utskrift upptäckt på sektionerad material 6. Även om det är svårt att rekonstruera från vävnadssnitt komplett avskrift mönster av hela embryon eller organsystem, gör tillämpningen av kromogena ISH förfaranden med icke-radioaktivt märkta sönder det möjligt att globalt upptäcka RNA fördel i hela-fästen 7. Även om många varianter av kromogena ISH finns, i typisk hela montera in situ hybridisering (WISH) protokoll hybridized hapten-märkta sönder upptäcks av anti-hapten-antikroppar konjugerade till en reporter enzym och mRNA transkript visualiseras genom en fällnings kromogen.
Paletten av olikfärgade fällningar som producerats av reportern enzymerna alkaliskt fosfatas (AP), pepparrotsperoxidas (POD), och beta-galaktosidas (gal) medger särskiljande detektion av flera mål i ett och samma prov 8-14. Men varar POD enzymatisk aktivitet under en begränsad tidsperiod och GAL kolorimetriska reaktionen är något mindre känslig, så att utan ytterligare signal (tyramide) förstärkning 15 detektion av mindre rikligt transkript kan vara en utmaning med dessa enzymer. Däremot bestående aktivitet AP möjliggör långvarig substratomsättning och hög signal-brusförhållande. Därför har sekventiell upptäckt med hjälp av AP reporter enzym med olikfärgade substrat visat sig framgångsrika i effektiv ochutmärkande detektering av upp till tre olika transkript i enstaka embryon 10-12,16.
För denna multi-mål kromogena WISH (MC-WISH) metoden (Figur 1) 14, är märkta antisens-RNA-prober som genereras av in vitro transkription och är markerade med en av de tillgängliga hapten-etiketter. Embryon är formaldehyd fast och permeabiliseras av metanol behandling och proteinas K matsmältningen. Hybridisering av embryon samtidigt utföras med upp till tre olika märkta antisense RNA-prober var specifika för en annan gen. Efter avlägsnande av obunden sond genom stringenta tvättar varje hapten-etikett visualiseras i en separat omgång för upptäckt. En enda upptäckt omgång består av inkubation av embryon med en anti-hapten antikropp kopplad till AP och RNA visualisering genom tillämpning av en AP-substrat som producerar en lokaliserad stabil färg fällning. Efter antikroppsdetektion och färgning, den tillämpade antikropp-AP conjugrinden avlägsnas genom ett lågt pH tvätt. I flerfärgs experiment, varje omgång av detektering utnyttjar en antikropp riktad mot en annan hapten märke och varje transkript mönstret visualiseras genom en annan färg substrat (Tabell 1). Embryon är monterade i glycerol och avbildas under ett högupplösande mikroskop med användning av differentialinterferenskontrast (DIC) optik.
In situ-hybridisering (ISH) med radioaktivt märkta nukleinsyraprober används ofta för att detektera lokaliseringen av RNA på vävnadssektioner. Den radioaktiva ISH-metoden, men är tidskrävande, mindre känslig, och inte tillåter uppskattning av kompletta transkript fördelningsmönster i hela-fästen. Däremot medger den här beskrivna MC-WISH metoden direkt jämförelse av flera genuttryck domäner i kontrasterande färger inom intakta embryon. MC-WISH har fördelen att histologiska sammanhanget är omedelbart uppenbar och visualiseras genom att helt enkelt standard bright mikroskopi. Detta ger möjlighet att relatera genuttryck domäner topografiskt varandra med hög noggrannhet och definiera unika och överlappande uttrycks platser i ett snabbt och tillförlitligt sätt. Å andra sidan, är multiplexerad fluorescerande ISH (FISH) kraftfullare med avseende på känslighet och upplösning och används företrädesvis, om cellulär eller ens subcellulär rekrävs lösning av mRNA-detektering.
Det breda spektrum av transkript som har kartlagts av MC-WISH tyder på att praktiskt taget alla transkript kan analyseras inte bara i outvecklad men också i larver och vuxna vävnader och i andra än Drosophila arter. Faktum är att beskrivna proceduren beskrivs här för Drosophila, fungerar på samma sätt effektivt med zebrafisk embryon 11,16,22. Dessutom kan MC-WISH-metoden anpassas till en mängd olika ryggradslösa och ryggradsdjur embryon och vävnadsprov.
Hapten-etiketter och probkoncentrationer
Vi använder rutinmässigt fluorescein, digoxigenin och biotin som hapten etiketter av RNA-prober. Dessutom, dinitrofenol-märkta sönder kan tillämpas som har införts i zebrafisk WISH experiment 23-25. Fluoresceinmärkt prober uppvisar mindre känslighet i jämförelse med de andra hapten-etiketter, så att fluorescein är bäst används feller detektering av rikliga transkript. Varje nyligen transkriberade proben först testas i en enda WISH experiment, där dess prestanda utvärderas antingen BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En sond koncentration anses vara optimal när en stark signal utan bakgrunds utveckling uppnås inom min till några timmar.
För att säkerställa att uttrycket domäner intresse har upptäckts i full utsträckning av MC-WISH, är det viktigt att synliggöra varje utskrift mönster genom en enda märkes WISH experiment med den mest känsliga substratkombination, BCIP / NBT. Detta säkerställer att svaga uttrycksdomäner inte förbises i multi-mål experiment. För att kompensera för den mindre känslighet av de andra substratkombinationer är det viktigt att använda fördubblats (till tredubblats) sondkoncentrationer jämfört med standard BCIP / NBT färgning.
Lågt pH inaktive
Det låga pH inaktiveringssteg kan leda tillpartiell sönderdelning av antisens-hapten-märkt RNA-sond / känsla mRNA hybrider som resulterar i minskad signaldetektering i andra och tredje färgnings rundor. För att minimera förlust i känslighet, de inaktiveringssteg är så korta som möjligt. Vi upplevde att en 10 minuters inkubationstid vid lågt pH är tillräcklig för eliminering av AP-aktivitet. De efterföljande snabba tvättar i stora volymer säkerställa en snabb utspädning av obundna antikropp-AP-konjugat och förhindra åter bindning till haptenized sonder. Alternativa förfaranden inkluderar paraformaldehyd fixering och värmeinaktivering. Men några av de färg fällningarna inte är värmestabilt och paraformaldehyd fixering kanske inte räcker för fullständig inaktivering av AP. Ofullständig inaktivering av den första anbringade antikropp-AP-konjugatet kan leda till re-visualisering av mRNA mönstret i följande detekteringen runda leder till falskt positiva överlappning i uttryck med de andra mRNA-typer som skall detekteras. Därför, i ett kontrollförsök the embryon delas upp i två fraktioner efter inaktivering av den första tillämpad antikropp-AP-konjugat. Den andra antikroppen-AP-konjugatet är utelämnad från kontrollfraktionen och bör inte alstra en signal i det andra färgreaktion. Om emellertid den andra färgreaktion alstrar en signal fördelningsmönster som motsvarar den första en, sedan inaktiveringsförfarandet var inte effektiv. I detta fall bör inkubationstiden i svagt stopplösning pH förlängas för nästa experiment.
Beställer av AP-substrat ansökan
Eftersom känsligheten minskar med varje efterföljande omgång av upptäckt, är det lämpligt att detektera mindre rikligt mRNA före rikligare avskrifter. Dessutom Fast Red och Fast Blue substratkombinationer är betydligt mindre känsliga än purpleblue BCIP / NBT fläck, så att snabba färgämnen företrädesvis tillämpas i första färgning runt för detektering av starkare uttryckt transkript. Också denna timsom den fördelen att efterföljande BCIP / NBT färgning kan övervakas och stoppas i tid innan purpleblue signalen blir för mörkt i förhållande till de lättare Snabba färgämnen. Således i en standard tvåfärgad experiment, först starkare uttryckt mRNA detekteras av Fast Red och andra den svagare en av BCIP / NBT. Som ett alternativ till de snabba färgämnen de gula INT substratkombinationer kan tillämpas, vilket dock producera fällningar som blir diffusa efter en viss tid. Därför BCIP / INT uteslutande tillämpas i den sista färgning omgången. Följaktligen i en tre-färg experiment använder vi ofta först Fast Red, andra BCIP / NBT (eller Fast Blue) och tredje en INT substratkombination. Observera att det är lämpligt att fotografera färgade embryon så snart som möjligt vid tillämpning INT.
Fluorescensdetektion av azofärgämnen
Det kan ibland vara svårt att känna igen överlappande uttrycksmönster när en mörkare färg fällning skuggar en ljusare. Feller exempel, kan en starkt utvecklad BCIP / NBT fällning mask ljusare Snabba färgsignaler. Ett sätt att komma runt detta problem är att omedelbart ta bilder efter varje färgning och ta bort den pålagda färgen fällningen innan nästa detekterings runda. I detta fall är alkohollösliga azo dye (Fast Red) och INT fällningar avlägsnades genom etanol tvättar efter den första och den andra detekterings rundor, respektive, och BCIP / NBT färgning används som den sista AP-substrat 26. En annan möjlighet är att dra fördel av de fluorescerande egenskaperna hos azofärgämnen. Fast Red kan visualiseras med rodamin filteruppsättningar 27, medan Fast Blue kan observeras med långt rött filter 28,29. Jämförelse eller överlagring av kromogena och fluorescerande bilder kan avslöja platsen för co-distribution.Using detta tillvägagångssätt, BCIP / NBT-signal utveckling måste stoppas i tid, så att det inte blir alltför tät och släcka den fluorescerande signalen från azofärgämnet reaktionsprodukt.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |