Vi beskriver en multi-target kromogenisk hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) prosedyre i intakte Drosophila embryoer tillater simultan og spesifikk påvisning av tre forskjellige mRNA fordelingsmønstre av kontrastfarger utfellinger.
For å analysere gen regulatoriske nettverk aktive under embryonal utvikling og organogenese er det viktig å presisere hvordan de forskjellige gener blir uttrykt i romlig forhold til hverandre in situ. Multi-target kromogenisk hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) i stor grad forenkler umiddelbar sammenligning av genutrykksmønster, som gjør det mulig karakteristiske visualisering av forskjellige mRNA arter i kontrastfarger i samme prøve prøven. Dette gir mulighet for å relatere genekspresjon domener topografisk til hverandre med stor nøyaktighet og til å definere unike og overlappende uttrykk områder. I presenterte protokollen beskriver vi en MC-WISH prosedyre for å sammenligne mRNA uttrykk mønstre av forskjellige gener i Drosophila embryoer. Opp til tre RNA-prober, hver spesifikk for et annet gen, og merket med et annet hapten, er samtidig hybridiserte til embryoet prøvene og senere detektert av alkali-ne fosfatase-basert kolo immunhistokjemi. Den beskrevne fremgangsmåte er detaljert her for Drosophila, men fungerer like godt med sebrafisk embryoer.
In situ hybridisering (ISH) er standardmetoden for påvisning og lokalisering av RNA-transkripter i et morfologisk sammenheng, innenfor celler, vev og organismer 1. Signalene som produseres av ISH prosedyren blir ofte visualisert ved radioaktive, fluorescerende og kromogeniske deteksjonssystemer. I de senere årene betydelige teknologiske fremskritt i fluorescerende ISH (fisk) 2 resulterte i dramatisk forbedret følsomhet og oppløsning, slik at påvisning og kvantifisering av RNA uttrykk ved encellede og sub-cellulære nivåer og RNA visualisering opp til enkle molekyler 3,4 .Mens sofistikerte single-molekyl FISH metoder brukes for mer spesialiserte programmer, er kromogenisk ISH utbredt som en rutine RNA in situ deteksjonsmetode i forskning og klinisk diagnostikk. For kromogen deteksjon brukes enzymet utfellingsreaksjoner, som genererer synlige produkter i kontrastfarger på nettstedeneav hybridisering 5. Dette har den fordelen at RNA visualisering kan kombineres med rutine histologiske flekker og morfologiske sammenheng er umiddelbart tydelig av standard lysfelt mikroskopi. Videre er mange av de anvendte farge substratene produserer utfellinger, som er stabile i organiske og / eller vandige medier montering, slik at permanente prøve preparater kan oppnås 5.
I Drosophila, innledende ISH protokoller brukt radioisotop-merkede prober for transkripsjon deteksjon på kåret material 6. Mens det er vanskelig å rekonstruere fra vevssnittene fullstendige transkriptmønstre hele embryoer eller organsystemer, gjør anvendelsen av kromogene ISH prosedyrer med ikke-radioaktivt merkede prober det mulig å foreta en total påvise RNA-fordelinger i hel-monteringer 7. Selv om mange varianter av kromogen ISH eksisterer, i typisk hel-mount in situ hybridisering (vil) protokoller hybridized hapten-merkede prober blir oppdaget av anti-hapten antistoffer konjugert til en reporter enzym og mRNA transkripsjoner er visualisert ved et utfellende kromogen.
Paletten av forskjellig fargede presipitater fremstilt av reporter enzymene alkalisk fosfatase (AP), pepperrot-peroksidase (POD) og beta-galaktosidase (GAL) gjør det mulig for den særegne deteksjon av flere mål i en og samme prøve 8-14. Imidlertid varer POD enzymatisk aktivitet bare i en begrenset tidsperiode, og GAL kolorimetrisk reaksjon er noe mindre følsom, slik at uten ekstra (tyramide) signalforsterkning 15 påvisning av mindre rikelig transkriptene kan være utfordrende med disse enzymene. I motsetning til dette, den varige aktiviteten av AP muliggjør langvarig substrat omsetning og høyt signal-til-støy-forhold. Derfor har vist, sekvensiell deteksjon ved hjelp AP reporter enzym med forskjellig fargede underlag vellykket i effektiv ogkarakteristiske deteksjon av opp til tre ulike transkripsjoner i enkle embryoer 10-12,16.
For denne multi-target kromogen WISH (MC-WISH) metode (figur 1) 14, er merket antisens RNA-prober ble generert ved de vitro transkripsjon og som er merket med ett av de tilgjengelige hapten-etiketter. Embryoer er formaldehyd faste og permeabilized av metanol behandling og proteinase K fordøyelsen. Hybridisering av embryoer er samtidig utført med opp til tre forskjellig merkede antisense-RNA-prober hver spesifikke for et annet gen. Etter fjerning av ubundet probe av stringens vaskinger hver hapten-etikett er anskueliggjort i en egen runde med deteksjon. En enkelt deteksjon runde består av inkubering av embryoer med et anti-hapten-antistoff koblet til AP, og RNA visualisering ved bruk av en AP-substrat som gir en lokalisert stabil farge bunnfall. Etter antistoffpåvisning og flekker, den anvendte antistoff-AP conjuPorten er fjernet ved en lav pH-vask. I flerfarget eksperimenter, hver runde av deteksjons anvendes et antistoff rettet mot et annet hapten-merket og hvert transkript mønster blir visualisert ved en annen farge substrat (tabell 1). Embryoer er montert i glyserol og avbildes under en høyoppløselig sammensatt mikroskop ved hjelp av differensial interferens kontrast (DIC) optikk.
In situ hybridisering (ISH) med radioaktivt merkede nukleinsyreprober blir ofte brukt til å detektere lokalisering av RNA på vevssnitt. Den radioaktive ISH metoden er imidlertid tidkrevende, mindre følsom, og tillater ikke verdsettelse av komplette karakterfordelingsmønstre i hel-mounts. I kontrast, tillater heri beskrevet MC-WISH metoden direkte sammenligning av flere genuttrykk domener i kontrastfarger innen intakte embryoer. MC-WISH har den fordelen at histologisk sammenheng er umiddelbart tydelig og visualisert bare ved standard lysfelt mikroskopi. Dette gir mulighet for å relatere genekspresjon domener topografisk til hverandre med stor nøyaktighet og definere unike og overlappende uttrykk områder i en rask og pålitelig måte. På den annen side er multiplekset fluorescerende ISH (FISH) kraftigere med hensyn til sensitivitet og oppløsning, og blir fortrinnsvis anvendt, hvis mobil eller sub-cellulære reoppløsning av mRNA deteksjon er nødvendig.
Det brede spekteret av transkripter som er kartlagt ved MC-WISH tyder på at praktisk talt alle transkripsjon kan analyseres ikke bare i embryonale, men også i larver og voksne vev og i andre enn Drosophila arter. Faktisk, den beskrevne fremgangsmåten beskrevet her for Drosophila, fungerer på samme effektive med sebrafisk embryo 11,16,22. Videre kan MC-WISH metode tilpasses et bredt spekter av invertebrate og virveldyr embryoer og vevsprøve.
Haptenet-etiketter og probe konsentrasjoner
Vi bruker rutinemessig fluorescein, digoxigenin, og biotin som hapten etikettene av RNA-prober. Videre dinitrofenol-merkede prober kan påføres, som har blitt introdusert i sebrafisk WISH eksperimenter 23-25. Fluorescein-merkede prober vise en mindre følsomhet i forhold til de andre hapten-etiketter, slik som fluorescein er best brukes feller deteksjon av rikelig transkripsjoner. Hver nylig transkriberes sonden er først testet i en enkelt WISH eksperiment, der ytelsen blir evaluert bruker BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En sonde konsentrasjon anses som optimal når et sterkt signal uten bakgrunn utvikling er oppnådd innen minutter til noen få timer.
For å være sikker på at uttrykket domener av interesse har blitt oppdaget i sin fulle utstrekning av MC-WISH, er det viktig å visualisere hver transkripsjon mønster av single-label WISH eksperimenter med den mest sensitive underlaget kombinasjon, BCIP / NBT. Dette sikrer at svake uttrykk domener ikke blir oversett i multi-target eksperiment. For å kompensere for den mindre følsomhet av de andre underlagskombinasjoner er det viktig å bruke fordoblet (for å tredoblet) probe konsentrasjoner sammenlignet med standard BCIP / NBT farging.
Lav pH inaktive
Den lave pH-inaktiveringstrinnet kan føre tildelvis desintegrering av antisense-hapten-merket RNA-probe / forstand mRNA-hybrider som resulterer i redusert deteksjonssignal i den andre og tredje fargings runder. For å minimere tap i følsomhet, er inaktiveringsfremgangsmåten er så korte som mulig. Vi har erfart at en 10 minutters inkubering tid ved lav pH er tilstrekkelig for eliminering av AP-aktivitet. De påfølgende raske vasker i store volumer sikre rask fortynning av ubundet antistoff-AP konjugater og forhindre re-binding til haptenized sonder. Alternative prosedyrer inkluderer paraformaldehyde fiksering og varmeinaktivering. Imidlertid er noen av de farge utfellinger ikke varmestabile og paraformaldehyd fiksering kan ikke være tilstrekkelig for fullstendig inaktivering av AP. Ufullstendig inaktivering av det første påførte antistoff-AP-konjugat kan føre til gjen visualisering av mRNA mønster i det følgende deteksjons runde fører til falske positive overlapping i uttrykk med den andre mRNA-arter som skal påvises. Derfor, i et kontrolleksperiment the embryoer blir splittet i to fraksjoner etter inaktivering av det første påførte antistoff-AP-konjugatet. Det andre antistoff-AP-konjugat er utelatt fra styre fraksjon, og bør ikke produsere et signal i den andre fargereaksjon. Imidlertid, hvis den andre fargereaksjonen frembringer et signal fordelingsmønster som svarer til den første, og deretter inaktive prosedyren var ikke effektiv. I dette tilfellet bør inkubasjonstiden ved lav pH stoppløsning forlenges til neste eksperiment.
Bestillinger av AP underlaget søknad
Siden følsomheten synker med hver påfølgende runde av gjenkjenning, er det tilrådelig å oppdage mindre rikelig mRNA før mer rikelig transkripsjoner. I tillegg Fast Red og vaskeekte blå underlagskombinasjoner er betydelig mindre følsom enn den purpleblue BCIP / NBT flekken, slik at rask fargestoffer er fortrinnsvis påført i den første runden farging for deteksjon av det sterkere uttrykt transkripsjon. Dette også hsom den fordelen at en etterfølgende BCIP / NBT farging kan overvåkes og stoppes i tide før purpleblue signal blir for mørk i forhold til de lettere Fast fargestoffer. Dermed i en standard to-farge eksperiment, først sterkere uttrykt mRNA blir oppdaget av Fast Red og andre svakere en etter BCIP / NBT. Som et alternativ til de gule fargestoffer Fast INT underlagskombinasjoner kan anvendes, noe som imidlertid produserer utfellinger som blir diffunderer etter en tid. Derfor BCIP / INT utelukkende anvendes i den siste runden farging. Følgelig i en tre-farge eksperiment vi ofte først Fast Red, andre BCIP / NBT (eller Fast blå) og tredje en INT substrat kombinasjon. Legg merke til at det er tilrådelig å beiset embryoer så snart fotografere som mulig når du søker INT.
Fluorescerende påvisning av azofargestoffer
Det kan noen ganger være vanskelig å kjenne igjen overlappende uttrykk mønstre når en mørkere farge bunnfallet skygging en lettere en. Feller eksempel kan en sterkt utviklet BCIP / NBT utfelling maskere lettere Raske dye signaler. En måte å komme rundt dette problemet er å ta bilder umiddelbart etter hver farging og fjerne den påførte farge bunnfallet før neste deteksjon runde. I dette tilfellet, er alkohol-oppløselige azo-fargestoff (Fast Red) og INT bunnfall fjernes ved etanolvaskinger etter den første og andre deteksjons runder, henholdsvis, og BCIP / NBT flekker brukes som den siste AP-substrat 26. En annen mulighet er å dra nytte av de fluorescerende egenskapene til azofargestoffer. Fast Red kan visualiseres ved hjelp rhodamin filter setter 27, mens Fast Blå kan observeres med vidt røde filtre 28,29. Sammenligning eller overlapping av kromogene og fluoriserende bilder kan avsløre stedet for co-distribution.Using denne tilnærmingen, BCIP / NBT signal utvikling har å bli stoppet i tide, slik at det ikke blir for tett og slukke fluorescenssignalet av azo fargestoff reaksjonsproduktet.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |