हम रंग अवक्षेप विषम द्वारा तीन अलग-अलग mRNA वितरण पैटर्न के एक साथ और विशिष्ट पहचान के लिए अनुमति देता बरकरार ड्रोसोफिला भ्रूण में एक बहु लक्ष्य वर्णजनीय पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण में (एम सी इच्छा) प्रक्रिया का वर्णन।
भ्रूण विकास और यह ठीक विभिन्न जीनों बगल में एक दूसरे के स्थानिक संबंध में व्यक्त कर रहे हैं कि कैसे परिभाषित करने के लिए आवश्यक है जीवोत्पत्ति के दौरान सक्रिय जीन विनियामक नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए। मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण (एम सी इच्छा) यह एक ही नमूना नमूना में विषम रंगों में अलग mRNA प्रजातियों की विशिष्ट दृश्य की अनुमति देता के रूप में बहुत, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के त्वरित तुलना की सुविधा में। इस संभावना को उच्च सटीकता के साथ एक दूसरे के लिए भौगोलिक विवरण के अनुसार जीन अभिव्यक्ति डोमेन संबंधित करने के लिए और अद्वितीय और ओवरलैपिंग अभिव्यक्ति साइटों को परिभाषित करने के लिए प्रदान करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला भ्रूण में विभिन्न जीनों की mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना के लिए एक एम सी-काश प्रक्रिया का वर्णन। तीन आरएनए जांच, प्रत्येक एक और जीन के लिए विशिष्ट है और एक अलग hapten द्वारा लेबल तक, भ्रूण के नमूने को एक साथ संकरित और बाद में क्षार से पता चला रहे हैंNE वर्णमिति इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री फॉस्फेट आधारित। वर्णित प्रक्रिया यहाँ ड्रोसोफिला के लिए विस्तृत है, लेकिन zebrafish भ्रूण के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है।
सीटू संकरण (ISH) में कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों 1 के भीतर एक रूपात्मक संदर्भ में पता लगाने और शाही सेना टेप के स्थानीयकरण, के लिए मानक तरीका है। ISH प्रक्रिया द्वारा उत्पादित संकेतों सामान्यतः, रेडियोधर्मी फ्लोरोसेंट और वर्णजनीय का पता लगाने प्रणालियों द्वारा कल्पना कर रहे हैं। हाल के वर्षों में फ्लोरोसेंट ISH में महत्वपूर्ण तकनीकी विकास (मछली) 2 एकल अणुओं 3,4 .While अप करने के लिए एकल कोशिका और उप सेलुलर स्तर और आरएनए दृश्य में पता लगाने और आरएनए अभिव्यक्ति के quantitation अनुमति देता है, नाटकीय रूप से सुधार संवेदनशीलता और संकल्प के परिणामस्वरूप परिष्कृत एकल अणु मछली तरीकों को और अधिक विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वर्णजनीय ISH अनुसंधान और नैदानिक निदान में सीटू का पता लगाने विधि में एक नियमित आरएनए के रूप में व्यापक है। वर्णजनीय का पता लगाने के लिए एंजाइम वर्षा प्रतिक्रियाओं स्थलों पर विषम रंगों में दिखाई दे उत्पादों उत्पन्न है, जो इस्तेमाल कर रहे हैंसंकरण 5 की। यह आरएनए दृश्य दिनचर्या ऊतकीय दाग और रूपात्मक संदर्भ के साथ जोड़ा जा सकता है कि लाभ मानक brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा तुरंत स्पष्ट है है। इसके अलावा, लागू रंग substrates के कई स्थायी नमूना तैयारियों 5 प्राप्त किया जा सकता है, ताकि जैविक और / या जलीय बढ़ते मीडिया में स्थिर रहे हैं जो अवक्षेप, उत्पादन।
ड्रोसोफिला में, प्रारंभिक ISH प्रोटोकॉल sectioned सामग्री 6 पर प्रतिलेख का पता लगाने के लिए रेडियो आइसोटोप लेबल जांच लागू होता है। यह ऊतक वर्गों से पूरे भ्रूण या अंग प्रणालियों की पूरी प्रतिलेख पैटर्न को फिर से संगठित करने के लिए मुश्किल है, वहीं गैर-radioactively लेबल जांच के साथ वर्णजनीय ISH प्रक्रियाओं के आवेदन के लिए यह संभव पूरे आरोह 7 में शाही सेना वितरण का पता लगाने के लिए विश्व स्तर पर बनाता है। वर्णजनीय ISH के कई रूपों मौजूद हैं, ठेठ में सीटू संकरण (इच्छा) प्रोटोकॉल hyb में पूरे माउंटridized hapten लेबल जांच विरोधी hapten एंटीबॉडी एक पत्रकार एंजाइम संयुग्मित और mRNA टेप एक precipitating वर्णकोत्पादक द्वारा कल्पना कर रहे हैं से पता चला रहे हैं।
संवाददाता द्वारा उत्पादित अलग रंग अवक्षेप की पट्टी alkaline फॉस्फेट (एपी), हॉर्सरैडिश peroxidase (पॉड), और बीटा galactosidase (लड़की) से एक में कई लक्ष्यों के विशिष्ट पता लगाने और एक ही नमूना 8-14 के लिए अनुमति देता है एंजाइमों। हालांकि, पॉड enzymatic गतिविधि केवल एक सीमित समय अवधि के लिए रहता है और अतिरिक्त (tyramide) संकेत प्रवर्धन 15 कम प्रचुर मात्रा में टेप का पता लगाने के लिए इन एंजाइमों के साथ चुनौतीपूर्ण हो सकता है बिना इतना है कि लड़की वर्णमिति प्रतिक्रिया है, कुछ हद तक कम संवेदनशील है। इसके विपरीत, एपी के स्थायी गतिविधि लंबे समय से स्थायी सब्सट्रेट कारोबार और उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए अनुमति देता है। इसलिए, अलग रंग substrates के साथ एपी रिपोर्टर एंजाइम का उपयोग अनुक्रमिक का पता लगाने के लिए प्रभावी करने में सफल साबित हो गया है औरएकल भ्रूण 10-12,16 में करने के लिए तीन अलग-अलग टेप की विशिष्ट पहचान।
इस बहु लक्ष्य वर्णजनीय इच्छा (एम सी इच्छा) विधि (चित्रा 1) 14 के लिए, लेबल antisense शाही सेना जांच में इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और उपलब्ध hapten-लेबल के साथ चिह्नित। भ्रूण फॉर्मेल्डीहाइड तय की और मेथनॉल उपचार और proteinase कश्मीर पाचन द्वारा permeabilized हैं। भ्रूण के संकरण एक साथ करने के लिए तीन अलग लेबल antisense शाही सेना जांच के लिए एक अलग जीन के लिए प्रत्येक विशिष्ट साथ किया जाता है। तंगी washes के द्वारा अनबाउंड जांच को हटाने के बाद प्रत्येक hapten-लेबल का पता लगाने का एक अलग दौर में कल्पना की है। एक एकल का पता लगाने दौर एक स्थानीय स्थिर रंग वेग पैदा करता है कि एक एपी सब्सट्रेट के आवेदन के द्वारा एपी और आरएनए दृश्य करने के लिए मिलकर एक विरोधी hapten एंटीबॉडी के साथ भ्रूण की ऊष्मायन के होते हैं। एंटीबॉडी का पता लगाने और धुंधला, लागू एंटीबॉडी एपी conju के बादगेट एक कम पीएच धोने से निकाल दिया जाता है। बहुरंगा प्रयोगों में, पता लगाने के प्रत्येक दौर के एक अलग hapten-लेबल के खिलाफ लक्षित एक एंटीबॉडी को रोजगार और प्रत्येक प्रतिलिपि पैटर्न एक अलग रंग सब्सट्रेट (1 टेबल) द्वारा कल्पना की है। भ्रूण ग्लिसरॉल में मुहिम शुरू की और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी का उपयोग कर एक उच्च संकल्प यौगिक खुर्दबीन के नीचे imaged हैं।
Radioactively लेबल न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ सीटू संकरण (ISH) में अक्सर ऊतक वर्गों पर शाही सेना के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए किया जाता है। रेडियोधर्मी ISH विधि, हालांकि, कम संवेदनशील समय लगता है, है, और पूरे आरोह में पूरा प्रतिलेख वितरण पैटर्न की सराहना की अनुमति नहीं है। इसके विपरीत, यहाँ बताया एम सी-काश विधि बरकरार भ्रूण के भीतर विषम रंगों में कई जीन अभिव्यक्ति डोमेन की सीधी तुलना परमिट। एम सी-काश ऊतकीय संदर्भ तुरंत स्पष्ट और मानक brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा बस कल्पना की कि लाभ है। इस संभावना को उच्च सटीकता के साथ एक दूसरे के लिए भौगोलिक विवरण के अनुसार जीन अभिव्यक्ति डोमेन संबंधित हैं और एक तेज और विश्वसनीय तरीके से अद्वितीय और अतिव्यापी अभिव्यक्ति साइटों को परिभाषित करने के लिए प्रदान करता है। दूसरी ओर, मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट ISH (मछली) संवेदनशीलता और संकल्प के संबंध में अधिक शक्तिशाली है और बेहतर है, तो सेलुलर या यहां तक कि उप सेलुलर फिर से इस्तेमाल किया जाता हैmRNA पता लगाने के समाधान की आवश्यकता है।
एम सी इच्छा से मैप किया गया है कि टेप की व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए लगभग किसी भी प्रतिलिपि भ्रूण में ही नहीं बल्कि लार्वा और वयस्क ऊतकों में और ड्रोसोफिला के अलावा अन्य प्रजातियों में न केवल विश्लेषण किया जा सकता है कि पता चलता है। दरअसल, ड्रोसोफिला के लिए यहाँ विस्तृत वर्णित प्रक्रिया, zebrafish भ्रूण 11,16,22 के साथ इसी तरह कुशल काम करता है। इसके अलावा, एम सी-काश विधि अकशेरुकी और कशेरुकी भ्रूण और ऊतक नमूना की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Hapten-लेबल और जांच सांद्रता
हम नियमित रूप से शाही सेना जांच के hapten लेबल के रूप में fluorescein, digoxigenin, और बायोटिन का उपयोग करें। इसके अलावा, Dinitrophenol लेबल जांच लागू किया जा सकता है, zebrafish इच्छा प्रयोगों 23-25 में पेश किया गया है। कि fluorescein सबसे अच्छा च प्रयोग किया जाता है, ताकि Fluorescein लेबल जांच, अन्य hapten-लेबलों की तुलना में एक कम संवेदनशीलता प्रदर्शितप्रचुर मात्रा में टेप की या पता लगाने। प्रत्येक नव लिखित जांच पहले अपने प्रदर्शन के रूप में सब्सट्रेट BCIP / एनबीटी या फास्ट लाल का उपयोग कर सकते हैं या तो मूल्यांकन किया जाता है, जहां एक भी इच्छा प्रयोग में परीक्षण किया है। पृष्ठभूमि विकास के बिना एक मजबूत संकेत कुछ घंटे के लिए मिनट के भीतर हासिल की है जब एक जांच एकाग्रता इष्टतम के रूप में माना जाता है।
ब्याज की अभिव्यक्ति डोमेन एम सी इच्छा से अपनी पूरी हद में पाया गया है कि यह सुनिश्चित करना है, यह सबसे संवेदनशील सब्सट्रेट संयोजन, BCIP / एनबीटी का उपयोग कर एकल-लेबल इच्छा प्रयोगों द्वारा प्रत्येक प्रतिलिपि पैटर्न कल्पना करने के लिए आवश्यक है। यह कमजोर अभिव्यक्ति डोमेन बहु लक्ष्य प्रयोग में अनदेखी नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करता है। अन्य सब्सट्रेट संयोजनों की कम संवेदनशीलता की भरपाई के लिए यह मानक BCIP / एनबीटी धुंधला की तुलना में जांच सांद्रता (तीन गुना करने के लिए) दोगुना करने के लिए आवश्यक है।
कम पीएच निष्क्रियता
कम पीएच निष्क्रियता कदम के लिए नेतृत्व कर सकते हैंदूसरे और तीसरे धुंधला दौर में कम संकेत का पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप antisense hapten लेबल शाही सेना जांच / भावना mRNA के संकर के आंशिक विघटन। संवेदनशीलता में नुकसान को कम करने के लिए, निष्क्रियता कदम के रूप में संभव के रूप में कम कर रहे हैं। हम कम पीएच में एक 10 मिनट ऊष्मायन समय एपी गतिविधि के उन्मूलन के लिए पर्याप्त है कि अनुभव किया। बड़ी मात्रा में बाद में त्वरित washes अनबाउंड एंटीबॉडी-एपी conjugates के तेजी से कमजोर पड़ने सुनिश्चित करने और haptenized जांच करने के लिए फिर से बाध्यकारी रोका जा सके। वैकल्पिक प्रक्रियाओं paraformaldehyde निर्धारण और गर्मी निष्क्रियता शामिल हैं। हालांकि, रंग अवक्षेप के कुछ स्थिर गर्मी नहीं कर रहे हैं और paraformaldehyde निर्धारण एपी की पूरी निष्क्रियता के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। पहली बार लागू एंटीबॉडी एपी रूप साधना का अधूरा निष्क्रियता के बाद पता लगाने के दौर से पता लगाया जा करने के लिए दूसरा mRNA प्रजातियों के साथ अभिव्यक्ति में झूठी सकारात्मक ओवरलैप करने के लिए अग्रणी में mRNA पैटर्न के दृश्य फिर से बढ़ सकता है। इसलिए, एक नियंत्रण प्रयोग वीं मेंई भ्रूण पहली बार लागू एंटीबॉडी एपी रूप साधना की निष्क्रियता के बाद दो भागों में विभाजित कर रहे हैं। दूसरी एंटीबॉडी एपी संयुग्म नियंत्रण अंश से छोड़ा जाता है और दूसरे रंग की प्रतिक्रिया में एक संकेत का उत्पादन नहीं करना चाहिए। दूसरे रंग की प्रतिक्रिया पहले एक करने के लिए इसी एक संकेत वितरण पैटर्न उत्पन्न हालांकि, अगर है, तो निष्क्रियता प्रक्रिया कुशल नहीं था। इस मामले में, कम पीएच स्थान पर समाधान में ऊष्मायन समय अगले प्रयोग के लिए लंबे समय तक किया जाना चाहिए।
एपी सब्सट्रेट आवेदन के आदेश
संवेदनशीलता का पता लगाने के प्रत्येक बाद के दौर के साथ चला जाता है, यह पूर्व के अधिक प्रचुर मात्रा में टेप करने के लिए कम प्रचुर मात्रा में mRNAs का पता लगाने की सलाह दी जाती है। फास्ट रंजक अधिमानतः मजबूत व्यक्त प्रतिलेख का पता लगाने के लिए पहले धुंधला दौर में लागू किया जाता है, ताकि इसके अलावा, फास्ट लाल और फास्ट ब्लू सब्सट्रेट संयोजन, काफी purpleblue BCIP / एनबीटी दाग से कम संवेदनशील होते हैं। यह भी जबाद में BCIP / एनबीटी धुंधला नजर रखी और purpleblue संकेत हल्का फास्ट रंगों के संबंध में भी अंधेरा हो जाता है से पहले समय में बंद कर दिया जा सकता है कि लाभ के रूप में। इस प्रकार एक मानक दो रंग प्रयोग में, पहले मजबूत व्यक्त mRNA फास्ट लाल ने पता लगाया है और दूसरा एक कमजोर BCIP / एनबीटी से। लेकिन कुछ समय के बाद फैलाना हो जाते हैं कि अवक्षेप उत्पादन जो पीले INT सब्सट्रेट संयोजन लागू किया जा सकता है तेजी से रंगों के लिए एक विकल्प के रूप में। इसलिए BCIP / int विशेष रूप से पिछले धुंधला दौर में लागू किया जाता है। नतीजतन एक तीन रंग प्रयोग में हम अक्सर पहले फास्ट लाल, दूसरी BCIP / एनबीटी (या फास्ट ब्लू) और तीसरे एक INT सब्सट्रेट संयोजन का उपयोग करें। यह INT आवेदन करते समय जितनी जल्दी हो सके दाग भ्रूण तस्वीर करने के लिए सलाह दी जाती है कि ध्यान दें।
AZO रंगों के फ्लोरोसेंट का पता लगाने
यह एक काले रंग के वेग एक लाइटर एक ग्रहण किया जाता है जब ओवरलैपिंग अभिव्यक्ति पैटर्न पहचान करने के लिए कभी कभी मुश्किल हो सकता है। एफया उदाहरण के लिए, एक जोरदार विकसित BCIP / एनबीटी वेग हल्का फास्ट डाई संकेतों मुखौटा कर सकते हैं। इस समस्या के आसपास पाने के लिए एक तरह से प्रत्येक धुंधला करने के बाद तुरंत छवियों पर कब्जा करने और अगले पता लगाने के दौर से पहले लागू रंग वेग को दूर करने के लिए है। इस मामले में, शराब में घुलनशील AZO डाई (फास्ट लाल) और int अवक्षेप क्रमश: पहले और दूसरे का पता लगाने के दौर के बाद इथेनॉल washes के द्वारा हटा दिया जाता है, और BCIP / एनबीटी धुंधला पिछले एपी सब्सट्रेट 26 के रूप में लागू किया जाता है। एक और संभावना AZO रंगों के फ्लोरोसेंट गुणों का लाभ ले रहा है। फास्ट ब्लू दूर लाल फिल्टर 28,29 के साथ मनाया जा सकता है, जबकि फास्ट लाल, 27 सेट rhodamine फिल्टर का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। यह भी घने हो जाते हैं और AZO डाई का फ्लोरोसेंट संकेत नहीं बुझ करता है, ताकि तुलना या वर्णजनीय और फ्लोरोसेंट छवियों के ओवरले, समय में बंद कर दिया जाना गया है सह distribution.Using इस दृष्टिकोण, BCIP / एनबीटी संकेत विकास की साइट प्रकट कर सकते हैं प्रतिक्रिया उत्पाद।
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |