Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.
Zu analysieren Genregulationsnetzwerken während der embryonalen Entwicklung und der Organogenese ist es wichtig, genau zu bestimmen, wie die verschiedenen Gene werden in räumlicher Beziehung zueinander in situ exprimiert aktiv. Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) erleichtert die sofortige Vergleich der Genexpressionsmuster, da es markante Darstellung der verschiedenen mRNA-Spezies in kontrastierenden Farben in der gleichen Probe Probe. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und um einzigartige und überlappenden Expressionsstellen definieren. In der vorgestellten Protokoll beschreiben wir eine MC-WISH Verfahren zum Vergleich der mRNA-Expressionsmuster verschiedener Gene in Drosophila-Embryos. Bis zu drei RNA-Sonden, die jeweils spezifisch für ein anderes Gen von einem anderen Hapten markiert ist, gleichzeitig hybridisierten, um den Embryo Proben und anschließend durch alkalische detektiertenne Phosphatase-basierten colorimetrischen Immunhistochemie. Die beschriebene Vorgehensweise ist hier für Drosophila beschrieben, funktioniert aber genauso gut mit Zebrafischembryonen.
In situ-Hybridisierung (ISH) ist das Standardverfahren zur Detektion und Lokalisierung von RNA-Transkripten in morphologischer Zusammenhang innerhalb von Zellen, Geweben und Organismen. 1 Die von der ISH Verfahren erzeugten Signale werden häufig von radioaktiven, fluoreszierenden und chromogenen Detektionssysteme visualisiert. In den letzten Jahren erhebliche technologische Fortschritte in Fluoreszenz ISH (FISH) 2 führte dramatisch verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung, was den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Expression auf Einzelzell und subzellulären Ebenen und RNA Visualisierung bis zu einzelnen Molekülen 3,4 .While anspruchsvolle Einzelmolekül FISH Methoden für mehr spezialisierte Anwendungen verwendet werden, ist chromogenen ISH verbreitet als eine Routine-RNA in situ Nachweisverfahren in der Forschung und der klinischen Diagnostik. Für chromogenen Nachweisenzym Fällungsreaktionen verwendet werden, die sichtbare Produkte in kontrastierenden Farben an den Standorten zu generierenHybridisierungs 5. Dies hat den Vorteil, dass RNA Visualisierung kann mit Routine histologischen Färbungen und morphologischer Zusammenhang kombinierbar ist durch Standardhellfeldmikroskopie unmittelbar ersichtlich. Darüber hinaus sind zahlreiche der aufgetragenen Farbsubstraten Ausscheidungen, die in der organischen und / oder wässrigen Medien stabil sind Montage, so dass eine permanente Probenzubereitungen erhalten werden 5.
Bei Drosophila angewendet Anfangs ISH Protokolle Radioisotop markierten Sonden für Transkript Erkennung auf geschnittene Material 6. Während es schwierig ist, aus Gewebeschnitten rekonstruieren vollständige Transkript Muster der gesamten Embryos oder Organsysteme, das die Anwendung von chromogenen ISH Verfahren mit nicht-radioaktiv markierte Sonden ermöglicht es, global zu erfassen RNA Verteilungen in Voll Halterungen 7. Obwohl viele Variationen von chromogenen ISH vorhanden sind, in typischer ganze-mount in situ Hybridisierung (WISH) Protokolle hybridized haptenmarkierte Sonden durch Anti-Hapten-Antikörper mit einem Reporterenzym konjugiert ist und der mRNA-Transkripte werden durch ein Fällungs Chromogen visualisiert detektiert.
Die Palette von unterschiedlich gefärbten Niederschläge durch das Reportergen produzierten Enzyme alkalische Phosphatase (AP), Meerrettich-Peroxidase (POD) und beta-Galactosidase (GAL) ermöglicht die Unterscheidungs Nachweis mehrerer Ziele in ein und derselben Probe 8-14. Dauert jedoch POD enzymatische Aktivität nur für eine begrenzte Zeitdauer und die GAL kolorimetrischen Reaktion ist etwas weniger empfindlich ist, so dass ohne zusätzliche (Tyramid) Signalverstärkung 15 die Detektion von weniger häufigen Transkripte kann schwierig mit diesen Enzymen können. Im Gegensatz dazu die dauerhafte Aktivität von AP ermöglicht dauerhafte Substratumsatz und hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Daher Sequenzerkennung mit AP Reporter-Enzym mit unterschiedlich gefärbten Substrate in der effektiven bewährt undunverwechselbare Detektion von bis zu drei verschiedene Transkripte in einzelnen Embryonen 10-12,16.
Aus diesem Multi-Target-chromogenen WISH (MC-WISH) Methode (Abbildung 1) 14, werden markierte Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription erzeugt und mit einer der verfügbaren Hapten-Etiketten gekennzeichnet. Embryos sind Formaldehyd fixiert und durch Methanolbehandlung und Proteinase K Verdau permeabilisiert. Hybridisierung von Embryonen wird gleichzeitig mit bis zu drei unterschiedlich markierten Antisense-RNA-Sonden jeweils spezifisch für ein unterschiedliches Gen durchgeführt. Nach dem Entfernen der ungebundenen Sonde durch Stringenz Wäschen jeweils Hapten-Etikett wird in einem separaten Runde der Detektion visualisiert. Eine einzelne Erfassungs Runde besteht aus der Inkubation von Embryonen mit einem Anti-Hapten-Antikörpers an AP und RNA Visualisierung durch Anlegen eines AP-Substrat, das eine lokalisierte stabile Farb Präzipitat produziert gekoppelt. Nach der Antikörpererkennung und Färbung, die aufgetragene Antikörper-AP conjuGate wird durch einen niedrigen pH-Wäsche entfernt. Beim Mehrfarben Experimenten verwendet jede Runde der Detektion eines Antikörpers gegen ein anderes Hapten-Etikett gezielt und jedes Transkript Muster durch eine unterschiedliche Farbe Substrat (Tabelle 1) visualisiert. Die Embryonen werden in Glycerin montiert und unter einem hochauflösenden Mikroskop Verbindung mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik abgebildet.
In situ-Hybridisierung (ISH) mit radioaktiv markierten Nukleinsäuresonden wird oft verwendet, um die Lokalisierung von RNA an Gewebeschnitten zu detektieren. Die radioaktiven ISH-Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, weniger empfindlich, und nicht Aufwertung komplette Transkript Verteilungsmuster ganz-Halterungen ermöglichen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene MC-WISH Verfahren den direkten Vergleich der multiplen Genexpression Domänen in kontrastierenden Farben in intakten Embryonen. MC-WISH hat den Vorteil, dass die histologische Kontext sofort ersichtlich und einfach durch Standard-Hellfeldmikroskopie visualisiert. Dies bietet die Möglichkeit, die Genexpression Domänen topographisch zueinander mit hoher Genauigkeit zu beziehen und festlegen einzigartige und überlappenden Expressionsstellen in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise. Auf der anderen Seite, ist Multiplex-Fluoreszenz ISH (FISH) leistungsfähiger in Bezug auf Empfindlichkeit und Auflösung und wird bevorzugt verwendet, wenn zelluläre oder subzelluläre WiederLösung von mRNA-Nachweis erforderlich ist.
Das breite Spektrum von Transkripten, die durch MC-WISH kartiert wurde legt nahe, dass praktisch jedes Transkript kann nicht nur in der embryonalen als auch in Larven und erwachsene Gewebe und in anderen als Drosophila-Arten analysiert werden. Tatsächlich ist die beschriebene Vorgehensweise für Drosophila hier detailliert, funktioniert ähnlich effizient mit Zebrafischembryonen 11,16,22. Darüber hinaus kann der MC-WISH Methode, um eine Vielzahl von Wirbellosen und Wirbeltierembryonen und Gewebeprobe angepasst werden.
Hapten-Etiketten und Sondenkonzentrationen
Wir verwenden routinemäßig Fluorescein, Digoxigenin und Biotin als Hapten-Markierungen von RNA-Sonden. Außerdem Dinitrophenol-markierte Sonden können verwendet werden, die im Zebrafisch WISH Experimente 23-25 eingeführt wurden. Fluorescein-markierten Sonden zeigen eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu den anderen Hapten-Etiketten, so dass Fluorescein wird am besten verwendet foder den Nachweis von reichlich vorhandenen Transkripte. Jeder neu transkribierten Sonde wird zunächst in einem einzigen WISH Versuchs, in dem seine Leistung wird entweder unter Verwendung von BCIP / NBT oder Fast Red als Substrat bewertet getestet. Eine Sonde Konzentration wird als optimal betrachtet werden, wenn ein starkes Signal, ohne Hintergrundentwicklung wird im Minuten bis wenigen Stunden erreicht.
Um sicherzustellen, dass die Expressionsdomänen von Interesse haben, in vollem Umfang von MC-WISH erfasst wurde, ist es wichtig, jedes Transkript Muster von einzelnen Bezeichnung WISH Experimente unter Verwendung der empfindlichsten Substrat-Kombination, BCIP / NBT zu visualisieren. Dies stellt sicher, dass eine schwache Expression Domänen sind nicht in der Multi-Target-Experiment übersehen. Um sich für die geringere Empfindlichkeit der anderen Substrat-Kombinationen zu kompensieren ist es wichtig, verdoppelt Gebrauch (bis zu verdreifacht) Sondenkonzentrationen im Vergleich zu Standard-BCIP / NBT-Färbung.
Niedrigen pH-Inaktivierung
Der niedrige pH Inaktivierungsschritt kann dazu führen,partielle Auflösung der Antisense haptenmarkierte RNA Sonde / Sense-mRNA-Hybride, was zu reduzierten Signalerfassung in dem zweiten und dritten Färbung Runden. Zu einem Verlust der Empfindlichkeit zu minimieren, sind die Inaktivierungsschritte so kurz wie möglich. Wir erlebten, dass ein 10 Minuten Inkubationszeit bei niedrigem pH-Wert reicht für Beseitigung der AP-Aktivität. Die anschließenden schnellen Waschungen in großen Stückzahlen sorgen für eine schnelle Verdünnung der ungebundenen Antikörper-AP-Konjugate und re-Bindung an die haptenisierte Sonden zu verhindern. Alternative Verfahren umfassen Para Fixierung und Hitze-Inaktivierung. Allerdings sind einige der Farb Niederschläge sind nicht hitzestabil und Paraformaldehyd Fixierung kann nicht ausreichend für die vollständige Inaktivierung der AP ist. Unvollständigen Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat kann neu Visualisierung der mRNA-Muster in der folgenden Erkennungsrunde zu falsch positiven Überdeckung führt im Ausdruck mit der zweiten mRNA-Spezies zu erfassende führen. Daher wird in einem Kontrollexperiment the Embryonen nach der Inaktivierung der ersten aufgebrachten Antikörper-AP-Konjugat in zwei Fraktionen aufgeteilt. Der zweite Antikörper-AP-Konjugat wird von dem Kontrollfraktion weggelassen und sollte ein Signal in dem zweiten Farbreaktion nicht zu erzeugen. Wenn die zweite Farbreaktion erzeugt eine Signalverteilungsmuster entsprechend dem ersten, dann war jedoch die Inaktivierungsverfahren nicht effizient. In diesem Fall sollte die Inkubationszeit in niedrigen pH-Stop-Lösung für den nächsten Versuch verlängert werden.
Bestellungen von AP-Substrat-Anwendung
Da die Empfindlichkeit sinkt mit jeder weiteren Runde der Erkennung, ist es ratsam, weniger reichlich mRNAs vor reichlicher Transkripte nachzuweisen. Darüber hinaus ist die Fast Red und Fast Blue Substratkombinationen wesentlich weniger empfindlich als die purpleblue BCIP / NBT-Färbung, so dass schnelle Farbstoffe werden vorzugsweise in der ersten Runde Färbung zum Nachweis der stärker exprimiert Transkript aufgetragen. Dies auch hals Vorteil, dass anschließende BCIP / NBT-Färbung überwacht und gestoppt rechtzeitig vor purpleblue Signal wird zu dunkel im Hinblick auf die leichtere schnelle Farbstoffe werden. So ist in einer Standard-Zweifarbenexperiment erste desto stärker exprimierten mRNA wird von Fast Red erkannt und zweiten der Schwächere von BCIP / NBT. Als Alternative, um die schnelle Farbstoffe die gelben INT Substrat-Kombinationen angewendet werden können, die jedoch Präzipitate werden, nachdem einige Zeit diffundieren zu erzeugen. Daher BCIP / INT wird ausschließlich in der letzten Runde Färbung aufgetragen. Somit in einer Drei-Farben-Experiment, das wir verwenden oft ersten Fast Red, zweiten BCIP / NBT (oder Fast Blue) und der dritte ein INT-Substrat-Kombination. Man beachte, dass es ratsam ist, um Bunt Embryonen so schnell wie möglich zu fotografieren beim Aufbringen INT.
Fluoreszenzdetektion von Azofarbstoffen
Es kann manchmal schwierig sein, sich überlappenden Expressionsmuster zu erkennen, wenn eine dunklere Farbe Niederschlag wird Spiegeln einer leichteren. Foder kann beispielsweise ein stark entwickelt BCIP / NBT Niederschlag leichter Schnelle Farbsignale zu maskieren. Eine Möglichkeit, um dieses Problem zu erhalten ist, Bilder nach jeder Färbung sofort erfassen und entfernen Sie das angewandte Farbniederschlag vor der nächsten Erkennung Runde. In diesem Fall sind alkohollösliche Azofarbstoff (Fast Red) und INT Niederschläge mit Ethanol wäscht, nachdem die ersten und zweiten Erfassungs Runden entfernt sind und BCIP / NBT-Färbung wird als letzter AP-Substrat 26 aufgebracht. Eine andere Möglichkeit ist, den Vorteil der Fluoreszenz-Eigenschaften von Azofarbstoffen zu nehmen. Fast Red kann mit Rhodamin-Filter visualisiert setzt 27 werden, während Fast Blue kann mit weit Rotfilter 28,29 beobachtet werden. Vergleichs- bzw. Überlagerung von chromogenen und Fluoreszenzbilder kann die Seite des Zusammen distribution.Using dieses Ansatzes BCIP / NBT Signalentwicklungs offenbaren muss rechtzeitig gestoppt werden kann, so dass es nicht zu dicht werden und Quench des Fluoreszenzsignals des Azofarbstoffes Reaktionsprodukt.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |