Vi beskriver et multi-target kromogent hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) proceduren i intakte Drosophila embryoner tillader samtidig og specifik påvisning af tre forskellige mRNA fordelingsmønster ved kontrasterende farve bundfald.
For at analysere genregulerende netværk, som arbejder under fosterudviklingen og organogenese er det vigtigt at præcist at definere, hvorledes de forskellige gener udtrykkes i fysisk forhold til hinanden in situ. Multi-target kromogent hel-mount in situ hybridisering (MC-WISH) i høj grad letter den foreliggende sammenligning af genekspressionsmønstre, da det giver mulighed karakteristiske visualisering af forskellige mRNA-arter i kontrastfarver i den samme prøve prøven. Dette giver mulighed for at relatere genekspression domæner topografisk til hinanden med stor nøjagtighed og definere unikke og overlappende ekspressionssteder. I den præsenterede protokol beskriver vi en MC-WISH fremgangsmåden ved sammenligning mRNA ekspressionsmønstre for forskellige gener i Drosophila embryoner. Op til tre RNA-prober, der er specifikke for et andet gen og mærket med en anden hapten, samtidigt hybridiseret til embryo prøver og efterfølgende detekteres med alkaline phosphatase-kolorimetrisk immunhistokemi. Den beskrevne procedure er detaljeret her for Drosophila, men fungerer lige så godt med zebrafisk embryoner.
In situ hybridisering (ISH) er den standard metode til påvisning og lokalisering af RNA-transkripter i en morfologisk sammenhæng inden celler, væv og organismer 1. Signalerne produceret af ISH proceduren er almindeligt visualiseres ved radioaktive, fluorescerende og chromogene detektionssystemer. I de seneste år betydelige teknologiske fremskridt inden for fluorescerende ISH (FISH) 2 resulterede i dramatisk forbedret følsomhed og opløsning, så påvisning og kvantificering af RNA-ekspression ved single-celle og sub-cellulære niveauer og RNA visualisering op til enkelte molekyler 3,4 .Mens sofistikerede enkelt-molekyle FISH metoder anvendes til mere specialiserede anvendelser, kromogent ISH er udbredt som en rutinemæssig RNA in situ påvisningsmetoden i forskning og klinisk diagnostik. Til kromogene detektion bruges enzym udfældningsreaktioner, som genererer synlige produkter i kontrastfarver på de stederaf hybridisering 5. Dette har den fordel, at RNA visualisering kan kombineres med rutinemæssige histologiske pletter og morfologiske sammenhæng er umiddelbart indlysende ved standard brightfield mikroskopi. Desuden mange af de anvendte farver substrater producerer udfældninger, som er stabile i organiske og / eller vandige montering medier, så permanente præparater prøve kan opnås 5.
I Drosophila, anvendes indledende ISH protokoller radioisotop-mærkede prober til påvisning transkript på sektioneret materiale 6. Selv om det er vanskeligt at rekonstruere fra vævssnit komplette transkriptmønstre af hele embryoner eller organsystemer, anvendelsen af chromogene ISH procedurer med ikke-radioaktivt mærkede prober gør det muligt at detektere RNA globalt distributioner i hel-mounts 7. Selvom mange variationer af kromogent ISH findes, i typisk hel-mount in situ hybridisering (WISH) protokoller hybridized hapten-mærkede prober detekteres af antihaptenantistoffer konjugeret til et reporter-enzym og mRNA-transkripter er synlige ved en udfældende chromogen.
Paletten af forskelligt farvede bundfald fremstillet ved reporterenzymer alkalisk phosphatase (AP), peberrodsperoxidase (POD) og beta-galactosidase (GAL) giver mulighed for påvisning af karakteristiske flere mål i en og samme prøve 8-14. Men POD enzymatisk aktivitet varer kun i en begrænset tidsperiode og GAL kolorimetriske reaktion er noget mindre følsom, så uden yderligere (tyramid) signalforstærkning 15 påvisning af mindre rigelige transkripter kan være en udfordring med disse enzymer. I modsætning hertil vedvarende aktivitet af AP muliggør langvarig substrat omsætning og højt signal-støjforhold. Derfor har sekventiel påvisning ved AP reporter enzym med forskelligt farvede substrater vist sig gode til en effektiv ogkarakteristisk påvisning af op til tre forskellige udskrifter i enkelte embryoner 10-12,16.
Til dette multi-target kromogent WISH (MC-WISH) metoden (figur 1) 14, er mærket antisense RNA-prober genereret ved in vitro transkription og mærket med et af de tilgængelige hapten-etiketter. Embryoner er formaldehyd faste og permeabiliseret med methanol behandling og proteinase K-fordøjelse. Hybridisering af embryoer samtidig udføres med op til tre forskelligt mærkede antisense RNA-prober specifikke for hver et andet gen. Efter fjernelse af ubundet probe ved stringens vask hver hapten-label visualiseres i en separat runde af detektion. En enkelt detektering runde består af inkubation af fostre med en antihaptenantistof koblet til AP og RNA visualisering ved anvendelse af en AP-substrat, som frembringer en lokal stabil farve bundfald. Efter antistofdetektering og farvning, den anvendte antistof-AP conjugate fjernes ved en lav pH vask. I flerfarvet eksperimenter, hver runde af detektering anvender et antistof rettet mod et andet hapten-etiket, og hver transkriptmønster visualiseres ved en anden farve substrat (tabel 1). Embryoner er monteret i glycerol og afbildes under en høj opløsning sammensat mikroskop ved anvendelse af differentiel interferens kontrast (DIC) optik.
In situ-hybridisering (ISH) med radioaktivt mærkede nukleinsyreprober anvendes ofte til at detektere lokalisering af RNA på vævssnit. Det radioaktive ISH-metoden er dog tidskrævende, mindre følsomme, og tillader ikke opskrivning af komplette udskrift fordeling mønstre i hel-mounts. I modsætning hertil er beskrevet heri MC-WISH fremgangsmåde tillader direkte sammenligning af flere genekspression domæner i kontrastfarver inden intakte embryoer. MC-WISH har den fordel, histologiske sammenhæng er umiddelbart indlysende og visualiseret ved blot standard brightfield mikroskopi. Dette giver mulighed for at relatere genekspression domæner topografisk til hinanden med stor nøjagtighed og definere unikke og overlappende ekspressionssteder på en hurtig og pålidelig måde. På den anden side, multiplekset fluorescerende ISH (FISH) er mere kraftfuld med hensyn til følsomhed og opløsning, og anvendes fortrinsvis, hvis cellulære eller endda sub-cellulære reopløsning af mRNA detektion er påkrævet.
Det brede spektrum af transkripter, der er blevet kortlagt af MC-WISH tyder på, at stort set alle transkript kan analyseres ikke blot i embryonale, men også i larver og voksne væv og i andre end Drosophila arter. Faktisk den beskrevne fremgangsmåde detaljeret her for Drosophila, fungerer på samme måde effektiv med zebrafisk embryoner 11,16,22. Desuden kan MC-WISH fremgangsmåde tilpasses til en bred vifte af hvirvelløse og hvirveldyr embryoner og vævsprøve.
Hapten-etiketter og probekoncentrationer
Vi bruger rutinemæssigt fluorescein, digoxigenin, biotin og som haptenmarkører af RNA-prober. Desuden dinitrophenol-mærkede prober kan anvendes, som er blevet indført i zebrafisk WISH eksperimenter 23-25. Fluorescein-mærkede prober vise en mindre følsomhed i sammenligning med de andre hapten-etiketter, således at fluorescein er bedst brugt feller detektion af rigelige transkripter. Hver nyligt transskriberede probe først testet i et enkelt WISH eksperiment, hvor indtjeningen vurderes enten ved hjælp af BCIP / NBT eller Fast Red som substrat. En probekoncentration betragtes som optimal, når et stærkt signal uden udvikling baggrund opnås inden min til nogle få timer.
For at sikre at udtrykket domæner af interesse er blevet påvist i deres fulde omfang af MC-WISH, er det vigtigt at visualisere hver udskrift mønster ved en enkelt-label WISH eksperimenter ved hjælp af den mest følsomme underlag kombination, BCIP / NBT. Dette sikrer, at svage udtryk domæner ikke er overset i den multi-target eksperiment. For at kompensere for den mindre følsomhed af de andre substratkombinationer er det vigtigt at bruge fordoblet (til tredoblet) probekoncentrationer sammenlignet med standard BCIP / NBT-farvning.
Lav pH inaktivering
Den lave pH inaktiveringstrin kan føre tildelvis opløsning af antisense hapten-mærket RNA-probe / sense mRNA hybrider resulterer i reduceret detekteringssignal i det andet og tredje farvning runder. For at minimere tab af følsomhed, inaktivering trin er så korte som muligt. Vi oplevede, at en 10 minutters inkubation ved lav pH er tilstrækkelig til fjernelse af AP-aktivitet. De efterfølgende hurtige vaske i store mængder sikre hurtig fortynding af ubundet antistof-konjugater AP og forhindre re-binding til de haptenized prober. Alternative procedurer omfatter paraformaldehydfiksering og varmeinaktivering. Imidlertid er nogle af de farvede bundfald ikke varme stabil og paraformaldehydfiksering måske ikke tilstrækkelig til fuldstændig inaktivering af AP. Ufuldstændig inaktivering af den første påførte antistof-konjugat AP kan føre til fornyet visualisering af mRNA mønster i følgende detektion runde fører til falsk positive overlap i udtryk med den anden mRNA-art, der skal påvises. Derfor, i et kontrolforsøg the embryoner er opdelt i to fraktioner efter inaktivering af den første påførte antistof-AP-konjugat. Det andet antistof-AP-konjugat er udeladt fra fraktion kontrol og bør ikke frembringe et signal i den anden farvereaktion. Men hvis den anden farvereaktion genererer et signal fordelingsmønster svarende til den første, og derefter inaktiveringsproceduren ikke var effektiv. I dette tilfælde bør inkubationstiden i lav pH stopopløsning forlænges for det næste forsøg.
Ordrer af AP-substrat ansøgning
Da følsomheden falder med hver efterfølgende runde af afsløring, er det tilrådeligt at opdage mindre rigelige mRNA'er før mere rigelige udskrifter. Hertil kommer, at Fast Red og Fast Blue substratkombinationer er betydeligt mindre følsom end purpleblue BCIP / NBT plet, så Fast farvestoffer fortrinsvis anvendes i den første runde farvning til påvisning af stærkere udtrykt transkript. Dette også hden fordel, at en efterfølgende BCIP / NBT-farvning kan overvåges og stoppet i god tid inden purpleblue signalet bliver for mørkt i forhold til de lysere Hurtig farvestoffer. Således i en standard tofarvet eksperiment først stærkere udtrykt mRNA påvises ved Fast Red og for det andet svagere én efter BCIP / NBT. Som et alternativ til de hurtige farvestoffer de gule INT substratkombinationer kan anvendes, som dog producerer bundfald, der bliver diffundere efter nogen tid. Derfor BCIP / INT kan udelukkende anvendes i den sidste farvning rundt. Derfor i en tre-farve eksperiment bruger vi ofte først Fast Red, andet BCIP / NBT (eller Fast Blue) og tredje en INT substrat kombination. Bemærk, at det er tilrådeligt at fotografere farvede embryoner så hurtigt som muligt, når de anvender INT.
Fluorescerende detektion af azofarvestoffer
Det kan være nogle gange svært at genkende overlappende ekspressionsmønstre når en mørkere farve bundfald skygger en lighter en. Feller eksempel kan en kraftigt udviklet BCIP / NBT bundfald maske lysere Hurtig farvestof signaler. En måde at komme omkring dette problem er at tage billeder umiddelbart efter hver farvning og fjern den anvendte farve bundfald inden næste afsløring runde. I dette tilfælde er alkohol-opløselige azo farvestof (Fast Red) og INT bundfald fjernet ved ethanol vasker efter den første og anden afsløring runder henholdsvis og BCIP / NBT-farvning anvendes som den sidste AP-substrat 26. En anden mulighed er at drage fordel af de fluorescerende egenskaber af azofarvestoffer. Fast Red kan visualiseres ved hjælp rhodaminfilteret sætter 27, mens Fast Blue kan iagttages med langt røde filtre 28,29. Sammenligning eller overlejring af kromogene og fluorescerende billeder kan afsløre stedet for co-distribution.Using denne fremgangsmåde, BCIP / NBT signal udvikling skal stoppes i tide, således at det ikke bliver for tæt og slukke det fluorescerende signal af azofarvestof reaktionsprodukt.
The authors have nothing to disclose.
We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors’ work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).
Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water | Thermo Scientific | R0603 | |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | |
RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0521 | |
NTP Set | Thermo Scientific | R0481 | |
Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
Fluorescein-12-UTP | Roche | 11427857910 | |
Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
Ammonium acetate | Applichem | A2936 | |
Ethanol, absolute | Merck | 100983 | |
di-Sodium hydrogen phosphate | Scharlau | SO0339 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Scharlau | SO0331 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Methanol | Sigma | 32213 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Glycine | Sigma | G7126 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
tri-Sodium citrate | Scharlau | SO0200 | |
deionized formamide | Applichem | A2156 | |
RNA type VI from torula yeast | Sigma | R6625 | |
Heparin sodium salt | Applichem | A3004 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D6001 | |
Sheep serum | Sigma | S2263 | |
Sheep anti-biotin-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments | Roche | 11426303001 | |
Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody | Vector laboratories | MB-3100 | |
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane | Scharlau | TR04241000 | |
Magnesium chloride | Scharlau | MA0036 | |
Sodium chloride | Scharlau | SO0227 | |
Levamisole | Sigma | L9756 | |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 | |
Dimethylsulfoxide | Applichem | A3006 | |
Fast Red tablet set | Sigma | F4648 | |
Fast Blue BB salt | Sigma | F3378 | |
Naphthol-AS-MX-phosphate | Sigma | N5000 | |
Naphthol-AS-GR-phosphate | Sigma | N3625 | |
Naphthol-AS-BI-phosphate | Sigma | N2250 | |
Magenta-Phos | Biosynth | B7550 | |
INT | Sigma | I8377 | |
NBT | Applichem | A1243 | |
BCIP | Applichem | A1117 | |
INT/BCIP solution | Roche | 11681460001 | |
Glycerol 86-88% | Scharlau | GL0023 | |
Universal incubator | Memmert | BE400 | |
Waterbath | Memmert | WB14 | |
Heat block | Grant | QBT2 | |
Netwell inserts 15 mm | Corning | 3477 | |
Netwell carrier kit 15 mm | Corning | 3520 | |
12-well cell culture plate | Corning | 3513 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
1.5 ml microtube | Sarstedt | 72.690.001 | |
2.0 ml microtube | Sarstedt | 72.691 |