Transkriptom Profilering av<em> In-Vivo</em> Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Tidig foster förlust i högproducerande mjölkkor är en av de största utmaningarna inom mejeriindustrin ett, två. Nötkreatur har blivit en intressant modell för att studera mänsklig preimplantatorisk embryots utveckling på grund av deras liknande utvecklingsprocess 3, 4. Dock mer forskning behövs för att få bättre förståelse om gener som är involverade i bovint tidig embryonal utveckling.
Efter tjugo år sedan den första microarray teknik som utvecklats under 1995 5, utvecklingen av mer sofistikerade sond tillverkningsteknik minskade tryckfel och variationen av arraychip inom och mellan olika microarray plattformar 6. Förbättrad microarray-teknik resulterade i en allmänt tillämpning av denna teknik i klinisk forskning 7 och mer nyligen, i början av embryo qVALITET bedömning 8.
Den stora mängden erforderlig utrustning för microarray-tekniken är den främsta anledningen till microarray-teknik initialt misslyckats med att ange ett antal forskningsområden som tidig embryonal utveckling. På senare tid har RNA amplifieringsmetoder förbättrats för att linjärt förstärka RNA upp till mikrogram nivå från undernanogram utgångs RNA material 9. Det finns flera kommersiella RNA-amplifiering kit som finns på marknaden; emellertid de mer populära välutvecklade kit relaterade till Ribo-Single Primer Isotermisk Förstärkning 10 och T7-promotor drivs 11 metoder. De mest populära antisens-RNA förstärkning använder transkription in vitro med en oligo dT primer länka till en T7-promotor vid 5'-änden 12. Denna teknik gör det möjligt att upprätthålla de mest representativa antisenstranskript efter linjär förstärkning feller arrayer hybridisering 13. Denna metod har anpassats för att amplifiera pikogram nivå av totalt RNA extraherat från bovin embryo 8.
Universal lyftsystem (ULS) är den metod märkning som direkt innehåller DNA eller förstärkt RNA med platina bundna fluorescerande färgämne antingen Cyanine 547 eller Cyanine 647, genom att bilda en samordnande obligation på N7 position guanin 14. Denna metod har anpassats i embryon forskning för att generera mer stabil förstärkt ARNA utan ändringar jämfört med aminoallyl modifierade ARNA genereras genom enzymatisk metod 15. Både enda färgämne och två färgämnen märkningsmetoder har anpassats med hjälp av Universal Linkage System i microarray. En stor microarray jämförelser studie var att det finns en god korrelation av datakvalitet mellan de en- och två-färg array plattformar 6.
Nyligen både T7-promotor enhetn antisens-RNA förstärknings- och ULS märkningsmetoder har utvecklats för att ge en mer tillförlitlig protokoll för att generera en tillräcklig mängd högkvalitativa märkt aRNA material för microarray-hybridisering 8, 16. Därför ger denna studie ett protokoll för att visa några av de viktiga steg från RNA-extraktion till dataanalys inblandad i två färger microarray med hjälp av Dag 7 embryon från nötkreatur som ett exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det första problemet att utföra microarray analys med hjälp av Dag 7 embryon från nötkreatur inte får tillräckliga mängder av hög kvalitet RNA för att studera genuttryck. Traditionella fenol / kloroform RNA-extraktion och etanolutfällning metod rekommenderas inte för Dag 7 embryon, vilket resulterar i lågt utbyte och eventuell kvarvarande fenol hämmande RNA amplifieringsreaktionen. I stället är en standard kolumnbaserad metod bättre att isolera total-RNA och därefter eluera RNA med minimal elueringsbuf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
Referências
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
