Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Tidlig embryo tap i høye produserende melkekyr er en av hovedutfordringene i meieriindustrien 1, 2. Bovine har blitt en interessant modell for å studere human preimplantation embryo utvikling på grunn av deres tilsvarende utviklingsprosess 3, 4. Men mer forskning er nødvendig for å få bedre forståelse om gener involvert i storfe tidlig embryoutvikling.
Etter tjue år siden den første mikromatriseteknologi utviklet i 1995 fem, utvikling av mer sofistikerte sonde fabrikasjon teknologi reduserte trykkfeil og variasjon av Array chips innen og mellom ulike microarray plattformer 6. Forbedret mikromatriseteknologi resulterte i et allment bruk av denne teknologien i klinisk forskning 7 og mer nylig, tidlig embryo qKVALITET vurdering 8.
Den store mengden av nødvendig materiale for microarray-teknologi er den viktigste årsaken til at mikromatriseteknologi i utgangspunktet ikke klarte å legge inn en rekke forskningsfelt som tidlig embryoutvikling. Mer nylig har RNA amplifikasjonsmetoder blitt forbedret for å forsterke lineært RNA opp til mikrogram nivå fra sub-nanogram RNA utgangsmateriale 9. Det finnes flere kommersielle RNA forsterkersett er tilgjengelig på markedet; derimot, er de mer populære velutviklet kits relatert til Ribo-Single Primer Isoterm Amplification 10 og T7 promoter drevet 11 metoder. Den mest populære antisense RNA forsterkning bruker in vitro transkripsjon med en oligo dT primer koble til en T7 promoter på 5 'enden 12. Denne teknologien gjør det mulig å opprettholde mest mulig av representative anti-sense transkripsjoner etter lineær forsterkning feller arrays hybridisering 13. Denne metode er blitt tilpasset for å forsterke pikogram nivå av total RNA ekstrahert fra bovine embryo 8.
Universal hydraulikksystem (ULS) er merking metode som direkte omfatter DNA eller forsterkes RNA med platina bundet fluorescerende fargestoff enten cyanine 547 eller cyanine 647, ved å danne en koordinerende bånd på N7 posisjonen av guanin 14. Denne metoden ble tilrettelagt i embryo forskning for å generere mer stabil forsterket Arna uten forbehold i forhold til aminoallyl modifisert Arna generert ved enzymatisk metode 15. Både enkelt fargestoff og to fargestoffer merkemetoder er tilpasset bruker Universal hydraulikksystem i microarray. En stor microarray sammenligninger studien var at det er en god korrelasjon av datakvalitet mellom en- og to-farge matriseplattformer 6.
Nylig har både T7 promoter stasjonn antisens RNA forsterker og ULS merkingsmetoder er blitt utviklet for å tilveiebringe en mer pålitelig protokoll for å generere en tilstrekkelig mengde av høy kvalitet merket Arna materialer for microarray hybridisering 8, 16. Derfor denne studien gir en protokoll for å demonstrere noen av de viktige skritt fra RNA ekstraksjon til dataanalyse involvert i to farger microarray hjelp Dag 7 storfe embryoer som et eksempel.
Det første problemet å utføre mikromatriseanalyse ved anvendelse av dag 7 bovine embryoer er ikke å få tilstrekkelige mengder av høy kvalitet RNA for å studere genekspresjon. Tradisjonelle fenol / kloroform RNA ekstraksjon og etanol nedbør metoden anbefales ikke for Dag 7 embryoer, noe som resulterer i lavt utbytte og mulig left fenol hemme RNA forsterkning reaksjon. I stedet er en standard kolonne basert metode for bedre å isolere total RNA og deretter eluere den RNA med minimale elueringsbuffer for å øke ko…
The authors have nothing to disclose.
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
GAL file | Agilent Technologies | – |