Summary

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Published: February 16, 2016
doi:

Summary

Vi har etablerat en teknik för isolering, fenotypiska karaktärisering och funktionell analys av immunceller från mus tandkött.

Abstract

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

Introduction

Tandköttsvävnader omger humana och murina tänder och utsätts ständigt för komplexa biofilm av tanden 1. Immuncellnätverket polistandkötts barriären är viktigt att upprätthålla vävnadsintegritet, se homeostas med den lokala kommen mikrober och samtidigt ger effektiv immunitet mot patogena utmaning 2. För att uppnå homeostas, är immunsystemet noggrant anpassade till tandkötts miljön skapar en högt specialiserad immunceller nätverk, men ändå liten detalj är känd av tandköttsimmuncellpopulationer och deras roll för att upprätthålla vävnads immunitet 2.

När immun homeostas störs på tandköttet, antingen genom ökad värd känslighet och / eller närvaro av dysbiotic mikrobiella samhällen, ett inflammatoriskt tillstånd, uppstår parodontit 3 4. Parodontit är en vanlig inflammatorisk sjukdom, vilket leder till förlust av tand supporting strukturer. I sina allvarliga former det ses hos cirka 10% av befolkningen 5. Dissekera nyckelfaktorer som är involverade i parodontit känslighet och progression har visat sig svårt sex. Däremot har djurmodeller varit extremt användbar för att förstå mekanismerna bakom parodontit initiering och progression 7. Modeller kan användas för att definiera de viktigaste cellpopulationer och molekylära mediatorer som är avgörande för att upprätthålla immun homeostas och driva utvecklingen av parodontit. En sådan insikt kommer att förändra vår förståelse av tandköttet specifik reglering av immun homeostas och ytterligare vår nuvarande förståelse av sjukdomen patogenes.

Protocol

Alla experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll följde nödvändiga riktlinjer och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén, NIDCR / NIH. 1. Förbered i förväg Förbereda Komplett medium: RPMI kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 10% FBS. Förbered DNas media: 50 ml RPMI-medium kompletterat med 7,5 mikrogram DNas (Se frisk, hålla på is hela tiden). Förbered Kollagenas-DNas media: 5 …

Representative Results

För att åskådliggöra tillämpning av protokollet visar vi representativa resultat undersöker immunceller nätverk i tandköttet hos möss med och utan parodontit (WT kontra LFA – / -, figur 2A – C). Representativa FACS tomter visar levande CD45 + hematopoetiska celler i tandköttet (Figur 2A, 2C). Isolering och bearbetning av immunceller med detta protokoll ger tillräckligt många celler för …

Discussion

Den nuvarande tekniken med framgång ger ett stort antal immunceller (från en enda mus) lämplig, inte bara för fenotypisk karakterisering, men även för funktionella studier ex vivo. En annan grupp hade tidigare publicerat ett protokoll för att isolera och karaktärisera murin tandköttsimmunceller och introducerade värdet av att använda multi flödescytometri i studiet av parodontit i djurmodeller 9. Efter avsevärd felsökning nyckeln ändring i detta protokoll var att inkludera dissektion a…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.

Materials

Fine Scissors Fine science tools 14058-11
Scalpel Handle #3 Fine science tools 10003-12
Scalpel Blades #10 Fine science tools 10010-00 Sterile
Splinter Forceps Integra Miltex 6-304
Needles with regular bevel  BD Medical 305109 27G, 12.7 mm length
Monoject syringes Covidien 8881513934 Luer-lock tip, 3mL
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-049 Without Calcium and Magnesium
RPMI 1640 Lonza 12-167F Without L-glutamine
DNase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25-1G
Collagenase type IV Gibco (by Life technologies) 17104-019
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-products 100-106
Gentamicin 50 mg/ml Quality biological 120-098-661EA
Pen Strep Gibco (by Life technologies) 15140-122
L-Glutamine Gibco (by Life technologies) 25030-081
0.5M EDTA pH 8.0 Quality biological 351-027-721EA
50 mL tubes Corning 352070 Polypropylene, sterile
70 μM Cell Strainers Corning 352350
Petri dishes Corning 351029 Sterile
5 mL FACS tubes Corning 352052 Sterile
BD GolgiPlug BD Biosciences 555029 Contains brefeldin A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience 48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 eBioscience 47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC eBioscience 11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC eBioscience 12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 eBioscience 25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience 47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC eBioscience 11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC eBioscience 11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC eBioscience 11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC eBioscience 11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC eBioscience 11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC BD Pharmingen 553104

Referências

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., & Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., & Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I. Et Al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., & Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., & Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology / Edited By John E. Coligan … [Et Al.]. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M. Et Al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M. Et Al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229ra240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., & Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
check_url/pt/53736?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Dutzan, N., Abusleme, L., Konkel, J. E., Moutsopoulos, N. M. Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network. J. Vis. Exp. (108), e53736, doi:10.3791/53736 (2016).

View Video