وميكروبيدات انسداد المغناطيسي نموذج للحث على بصري ارتفاع ضغط الدم التي تعتمد الزرق في الفئران
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للحث على ارتفاع ضغط الدم في العين في العين الفئران ينتج عنه خسائر في خلايا الشبكية كما لوحظ في الزرق. يتم حقن ميكروبيدات المغناطيسي في الغرفة الأمامية وتنجذب إلى زاوية القزحية القرنوية باستخدام مغناطيس لمنع تدفق الخلط المائي.
Abstract
وقد تم استخدام نماذج القوارض الزرق ضروري لفهم الآليات الجزيئية التي تكمن وراء الفيزيولوجيا المرضية لهذا المرض الاعصاب سياقاتها. مع ظهور العديد من خطوط الماوس المعدلة وراثيا، وهناك اهتمام متزايد في نماذج الفئران محرض من ارتفاع ضغط الدم في العين. هنا، نقدم نموذجا انسداد الزرق على أساس حقن ميكروبيدات المغناطيسي في الغرفة الأمامية للعين باستخدام إبرة مجهرية معدلة مع شطبة الأوجه. تنجذب ميكروبيدات المغناطيسية إلى زاوية القزحية القرنوية باستخدام مغناطيس يده لمنع تصريف الخلط المائي من الغرفة الأمامية. هذا الاضطراب في ديناميات النتائج المائية في الارتفاع المطرد للضغط العين، مما يؤدي بعد ذلك الى خسارة في خلايا الشبكية، كما لوحظ في مرضى الجلوكوما البشري. نموذج ميكروبيدات انسداد الواردة في هذا المخطوط هو بسيط مقارنة بالطرازات الأخرى محرض الزرق وأيضا للغايةفعالة وقابلة للتكرار. الأهم من ذلك أن التعديلات المقدمة هنا التقليل القضايا المشتركة التي غالبا ما تنشأ في نماذج انسداد. أولا، استخدام إبرة مجهرية الزجاج المشطوف يمنع ارتداد ميكروبيدات ويضمن الحد الأدنى من الضرر يحدث في القرنية خلال الحقن، وبالتالي تقليل الآثار الناجمة عن الإصابات. ثانيا، استخدام ميكروبيدات المغناطيسية يضمن القدرة على جذب معظم حبات إلى زاوية القزحية القرنوية، والحد من فعالية عدد من الخرز عائم في الغرفة الأمامية وتجنب الاتصال مع الهياكل الأخرى (على سبيل المثال، القزحية، عدسة). وأخيرا، استخدام المغناطيس يده يسمح المرونة عند التعامل مع العين الماوس صغيرة لكفاءة توجيه ميكروبيدات المغناطيسية وضمان أن يكون هناك ارتداد القليل من ميكروبيدات من العين عندما يتم سحب إبرة مجهرية. وباختصار، فإن انسداد نموذج الفأر ميكروبيدات المقدمة هنا هو أداة تحقيق قوية لدراسة التغيرات الاعصاب التي تحدث أثناء ظهور وتطور من غلوغيبوبة.
Introduction
الجلوكوما هو المسببة للعمى حالة مستمرة بلا رجعة من شأنها أن تؤثر على ما يقدر بنحو 80 مليون شخص في جميع أنحاء العالم بحلول عام 2020 1. وفي مرضى الجلوكوما، هو سبب فقدان البصر بسبب وفاة الانتقائي للخلايا الشبكية العقدة (RGCs)، والخلايا العصبية الإخراج الذي نقل المعلومات البصرية من شبكية العين إلى الدماغ. الجلوكوما هو مرض الاعصاب المرتبطة بالعمر مع العديد من عوامل الخطر التي تعتبر الأكثر شيوعا هو ارتفاع ضغط العين (IOP). في الواقع، IOP هو عامل خطر قابل للتعديل الوحيد في الزرق والعلاجات الحالية تركز فقط على إدارة ضغط العين. ومع ذلك، والعوامل الوراثية الخلوية، والبيئية متعددة تؤثر على ظهور وتطور هذا المرض. ولذلك، فهم الآليات المختلفة التي تسهم في نهاية المطاف إلى موت الخلايا العصبية لا بد من تطوير علاجات فعالة لزرق.
نماذج حيوانية من الزرق ضرورية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المرض وتحديد واختبارعلاجات واعدة. وقد دفع تزايد توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا بما في ذلك سلالات خروج المغلوب الشرطية والفئران تحمل استشفاف الفلورسنت المشفرة وراثيا الحاجة إلى نماذج الزرق الفئران محرض. وقد تم تطوير عدة نماذج من القوارض الزرق على مر السنين (إعادة النظر في 2،3). في كثير من هذه النماذج، والتي يسببها الزرق عن طريق تعطيل ديناميات الخلط المائي، مما أدى إلى ارتفاع الضغط داخل المقلة. نماذج الانسداد، الذي يتم حقن ميكروبيدات أو غيرها من المواد في الغرفة الأمامية للعين لمنع تصريف مائي، اكتسبت شعبية في السنوات الأخيرة ويرجع ذلك جزئيا إلى السهولة النسبية لزيادة IOP 4-14.
تم تعديل نموذج ميكروبيدات انسداد الزرق، وحمل لأول مرة في الرئيسيات 12، الأرانب 8، والجرذان 4،9،11، مؤخرا لاستخدامها في الفئران 5،6،10. في هذه الدراسات، وحقن intracameral من ميكروبيدات البوليسترين، وحدها أو فيتوليفة مع المواد اللزجة، أسفرت عن IOP الارتفاع مما يؤدي إلى احق 6،10 الموت RGC. ومع ذلك، الجزر عندما يتم سحب الإبرة من العين وتهجير ميكروبيدات من زاوية القزحية القرنوية من المشاكل الشائعة التي تنشأ أثناء العملية. للحد من هذه السلبيات، وقد استخدمت مغناطيس لجذب ميكروبيدات المغناطيسية إلى زاوية القزحية القرنوية العين 4،9.
بروتوكول الموصوفة هنا هو إجراء تعديل على أساس دراسات سابقة 9،10 يستخدم ميكروبيدات المغناطيسية والمغناطيس يده تكييفها للعين الماوس (الشكل 1). وقد تم إدخال العديد من التعديلات الهامة في بروتوكول لدينا لضمان زيادة IOP فعالة وقابلة للتكرار في الفئران. أولا، ويتم حقن ميكروبيدات باستخدام إبرة مجهرية زجاج أعدت بعناية مع شطبة الأوجه. والأسطح الملساء الناتجة من إبرة مجهرية وكذلك طرفها شحذ يضمن الحد الأدنى من الضرركما لحقت ثقوب القرنية. استخدام هذا إبرة مجهرية زجاج النتائج أيضا في زيادة السيطرة عندما يدخل رأس إبرة مجهرية في الغرفة الأمامية، مما يقلل من خطر الهياكل القريبة الضارة مثل القزحية والعدسة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حقن آفة صغيرة تسهل القرنية إصلاح الذات، ويقلل من الآثار الناجمة عن الإصابات غير المرغوب فيها.
ثانيا، حقن ميكروبيدات المغناطيسية واستخدام المغناطيس يده يسمح مراقبة دقيقة لجذب الخرز إلى زاوية القزحية القرنوية في العين الماوس صغيرة. ميكروبيدات المغناطيسية التي هي 4.5 ميكرون في القطر استخدمت لهذا الحجم ميكروبيدات لم تسد افتتاح إبرة مجهرية إعداد والأهم من ذلك، حقن مرة واحدة، منعت هذه ميكروبيدات بشكل فعال تصريف الخلط المائي. هذا النهج ليس فقط يقلل الجزر من ميكروبيدات حقن، ولكن يضمن أيضا أن الحد الأقصى لعدد ميكروبيدات يتراكم في المنطقة المستهدفة لمنع بشكل فعال مائي الصرف الفكاهة. Furthermore، ويقلل من هذه الاستراتيجية أيضا عدد من الخرز عائم في الغرفة الأمامية وتجنب الاتصال مع غيرها من الهياكل، مثل القزحية والعدسة، ومنع مرور إلى غرفة الخلفي. بشكل جماعي، هذه التعديلات تضمن أن الجراحة حقن ميكروبيدات يتم تنفيذ بسهولة نسبية وفي الوقت المناسب مما أدى إلى تحريض تكرار للغاية وفعال ومستدام من ارتفاع ضغط الدم في العين في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية الفيديو المعروضة هنا يوفر مفصلة خطوة بخطوة تعليمات حول كيفية إجراء حقن intracameral من ميكروبيدات المغناطيسية للحث على نحو فعال وبتكاثر IOP الارتفاع في الفئران. هذه النتائج الإجراء في زيادة IOP حقت التي لا تتطلب حقن إضافية ويعزز اكتشاف سوما RGC وفقدان محور عصبي داخل 3 أسابيع الأولى من ارتفاع ضغط الدم في العين induction.Elevated IOP هو عامل خطر رئيسي لتطوير الزرق في البشر. لذلك، هذا هو الفئران العين نموذج الزرق التي تعتمد على ارتفاع ضغط الدم الثمين الذي لديه القدرة على مجموعة واسعة من التطبيقات.
والعيب المشترك المرتبطة حقن ميكروبيدات في الغرفة الأمامية يتعلق حبة الجزر من خلال موقع الحقن عندما يتم سحب الإبرة، والذي غالبا ما يؤدي إلى إعاقة جزئية فقط من تدفق مائي وزيادة التقلبات. لمعالجة هذه القضية، تم تنفيذ العديد من التعديلات الهامة. التنوب ر، وإعداد دقيق ل، إبرة مجهرية زجاج حادة نظيفة مع شطبة الأوجه أمر ضروري لنجاح الحقن من ميكروبيدات. وإبرة مجهرية أعدت بشكل صحيح يمكن اختراق للرقابة والسلس للالقرنية مع تطبيق الحد الأدنى من الضغط على سطح العين الحساسة. ثقب القرنية صغيرة يمنع ارتداد ميكروبيدات. بالإضافة إلى ذلك، إبرة مجهرية غرامة يقلل من خطر الهياكل القريبة الضارة مثل القزحية والعدسة، والذي يمكن أن يؤدي إلى التهاب غير المرتبطة المرض. ثانيا، تطبيق نقطة جذب يده إلى مناطق بصري الاستراتيجية أثناء وبعد الحقن جانبا مهما آخر لهذه التقنية. خلال الحقن، ويستخدم المغناطيس لرسم ميكروبيدات المغناطيسية إلى غرفة منع ارتداد الأمامي من ميكروبيدات عندما يتم سحب إبرة مجهرية. بعد الحقن، ثم يستخدم المغناطيس لتوجيه ميكروبيدات إلى زاوية القزحية القرنوية لمنع تدفق مائي النكتة.
خيمة "> وثمة مشكلة أخرى كثيرا ما تصادف في نماذج انسداد ميكروبيدات هو أن حقن حبة متكررة وغالبا ما تكون ضرورية لتحقيق حقت IOP ارتفاع 10،11. وهذا قد يكون نتيجة لميكروبيدات طرد من زاوية القزحية القرنوية مع مرور الوقت. إن الجمع بين المغناطيس يده، كما هو موضح أعلاه، وتحديد المواقع من الفأرة بعد العملية بشكل كبير على تحسين النتيجة. إن استخدام التخدير عن طريق الحقن، والتي تتيح المرونة لتحريك الرأس أثناء الإجراء، وتتطلب فترة نقاهة لفترة أطول بعد الجراحة، ويحظي. التنسيب لل الفأر مع العين تعمل متجهة لأعلى لبضع ساعات بعد الجراحة يساهم في تسوية ميكروبيدات في زاوية القزحية القرنوية ويقلل من خطر طرد مرة أخرى في الغرفة الأمامية.ضمان أن عدد حبات حقن يتسق نسبيا هو خطوة حاسمة أخرى لتقليل الاختلافات بين الحيوانات. منذ ميكروبيدات تستقر في بottom من الأنبوب، فمن الضروري أن التجانس التام الحل ميكروبيدات وسحب حجم مناسب في إبرة مجهرية في الوقت المناسب. حقن عدد أقل من الخرز في الغرفة الأمامية يمكن أن يؤدي إلى انسداد غير كامل من الهياكل الفكاهة الصرف المائية، التي من المرجح أن يؤدي ذلك إلى ضعف أو متغير الارتفاع IOP. وتجدر الإشارة، على الرغم من أن الهدف النهائي للحقن ميكروبيدات هو رفع الضغط داخل المقلة، ينبغي اتخاذ الحذر عند قياس IOP من الفئران مستيقظا أعلى من ذروة القيم الواردة في هذه الدراسة (~ 25 مم زئبق). غاية معالج ادخال و اخراج عالية تزيد من خطر الأضرار الدماغية، ويمكن أيضا أن يسبب الألم للحيوان. ينبغي النظر في ارتفاع الضغط داخل المقلة واحدة من العديد من العوامل في تقييم نجاح الجراحة. على هذا النحو، ينبغي قياس نتائج الإجراء بناء على عدة معايير منها ارتفاع الضغط داخل المقلة، RGC موت سوما، وفقدان محور عصبي.
على الرغم من أن بروتوكول الموصوفة هنا النتائج في معظم ميكروبيدات ناجحةلاي تسوية في زاوية، وجود قيود المحتملة لهذا النموذج هو أن تلك الخرزات التي لا تزال عائمة في الغرفة الأمامية قد تتداخل مع تصوير الشبكية الحية من خلال القرنية، وكذلك فحوصات الكهربية أو السلوكية التي تتطلب مرور الفعال للضوء. جانب آخر مهم في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج انسداد ميكروبيدات غير أن مدى IOP الارتفاع والانحطاط RGC لاحق يختلف مع العمر والخلفية الوراثية للفأرة تعمل [4]. ولذلك، فإن مدى IOP الارتفاع والجدول الزمني للRGC انحطاط يجب أن يتم تحديد لكل خط محدد وراثيا الماوس و / أو الفئة العمرية.
وهناك ميزة هذا النموذج هي أن النتائج IOP مرتفعة في الفقدان التدريجي للوفاة RGC خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الحقن ميكروبيدات، والموت كبير RGC تم الكشف في 3 أسابيع بعد العملية. وبالتالي، فإن هذا النموذج يمكن النظر في التغييرات في وقت مبكر و / أو الدقيقة التي تحدث في هذا دisease، قبل الصريحة RGC سوما وفقدان محور عصبي. لم يكن لوحظ زيادة كبيرة في وفاة RGC بين 3 و 6 أسابيع بعد تحريض من ارتفاع ضغط الدم في العين. في الواقع، لا تزال RGC سوما ومحوار خسارة مستقرة في ~ 22-25٪ ما بين 3 و 6 أسابيع على الرغم من النجاح وIOP ارتفاع حافظت على هذه النقاط مرة. قد تكون هناك حاجة لمدة أطول من IOP مستمرة لفقدان RGC إضافية تحدث في C57BL / 6 الفئران، التي يبدو أنها أكثر مقاومة للضرر RGC مقارنة مع سلالات الفئران الأخرى. 5 تعديلات إضافية على بروتوكول المعروضة هنا، بما في ذلك تعديل حجم حبة وحقن إضافية، قد تكون هناك حاجة لدراسة فقدان RGC في نقطة زمنية لاحقة. لذلك، لدينا بروتوكول مثالية للدراسات تركز على التغيرات المرضية المبكرة التي ترتبط مع متواضع التنكس العصبي RGC التي هي ذات الصلة إلى ظهور وتطور في وقت مبكر من الزرق البشري.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Materials
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
Referências
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neurociência. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
