Магнитный Microbead окклюзия Модель для индуцируют офтальмогипертензией-зависимых Глаукома у мышей
Summary
Здесь мы приводим протокол для индукции глазной гипертензии, в мышиных глаз, что приводит к потере ганглиозных клеток сетчатки, как наблюдалось при глаукоме. Магнитные микросферы инъецируют в переднюю камеру и притягиваются к угол передней камеры глазного яблока с помощью магнита, чтобы блокировать отток внутриглазной жидкости.
Abstract
Применение грызунах моделей глаукомы было важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе патофизиологии этого многофакторного нейродегенеративных заболеваний. С появлением многочисленных трансгенных линий мышей, растет интерес к индуцируемых мышиных моделях глазной гипертензии. Здесь мы представляем окклюзия модель глаукомы основана на введении магнитных микросфер в переднюю камеру глаза с использованием модифицированного микроиглы с фацетной скоса. Магнитные микросферы привлекают к радужно-роговичный угол, используя переносной магнит, чтобы заблокировать дренаж водянистой влаги из передней камеры. Это разрушение в водной динамики приводит к устойчивой высоте внутриглазного давления, что впоследствии приводит к потере ганглиозных клеток сетчатки, как это наблюдалось у пациентов с глаукомой человека. Модель Microbead окклюзия представлена в этой рукописи проста по сравнению с другими моделями индуцируемых глаукомы и также высокоэффективным и воспроизводимым. Важно отметить, что изменения, представленные здесь минимизировать общие вопросы, которые часто возникают в моделях прикуса. Во-первых, использование скошенной стеклянной микроиглы предотвращает обратный поток микрогранул и гарантирует, что минимальное повреждение происходит в роговице во время инъекции, тем самым уменьшая эффекты связаны с травмами. Во- вторых, использование магнитных микрогранул обеспечивает способность привлекать большинство бусинки к радужно – роговичный угол, эффективно уменьшая количество шариков , плавающих в передней камере , избегая контакта с другими структурами (например., Радужной оболочки, хрусталика). И, наконец, использование портативного магнита обеспечивает гибкость при работе с маленьким ушком мыши, чтобы эффективно направлять магнитные микрогранулы и убедиться, что существует мало рефлюкс микрошариков из глаза, когда микроиглы снимается. Таким образом, Microbead окклюзия мышиная модель, представленная здесь является мощным исследовательским инструментом для изучения изменений нейродегенеративные, которые происходят во время возникновения и прогрессирования Глаукома.
Introduction
Глаукома является прогрессивным и необратимым ослепление состояние , которое будет влиять на примерно 80 миллионов человек во всем мире к 2020 году 1. У пациентов с глаукомой, потеря зрения вызвана селективным смерти ганглиозных клеток сетчатки (РГК), выходные нейроны , которые передают визуальную информацию от сетчатка в мозг. Глаукома является возрастная нейродегенеративным заболеванием со многими факторами риска, из которых наиболее распространенным является повышенное внутриглазное давление (ВГД). Действительно, ВГД является единственным изменяемым фактором риска при глаукоме и современные методы лечения сосредоточиться исключительно на управлении глазное давление. Тем не менее, многочисленные генетические, клеточные и экологические факторы влияют на возникновение и прогрессирование этого заболевания. Таким образом, понимание различных механизмов, которые в конечном счете способствуют гибели нейронов имеет важное значение для разработки эффективных методов лечения глаукомы.
Животные модели глаукомы имеют важное значение для изучения патофизиологии заболевания и выявления и проверкиперспективные терапевтические средства. Повышение доступности трансгенных линий мышей, включая штаммы условных нокаутных и мышей, несущих генетически кодируемые флуоресцентные трассирующие продвинул необходимость индуцируемых мышиных моделей с глаукомой. Несколько моделей на грызунах глаукомы были разработаны в течение многих лет (обзор в 2,3). Во многих из этих моделей, глаукома индуцируется путем разрушения водной динамики юмор, в результате возвышения ВГД. Окклюзия модели, в которых микросферы или другие вещества , которые вводят в переднюю камеру глаза , чтобы блокировать водный дренаж, приобрели популярность в последние годы отчасти из – за их относительной легкости повышения ВГД 4-14.
Microbead окклюзия модель глаукомы, впервые осуществленный в приматах 12, кролики 8 и крыс 4,9,11, недавно был адаптирован для использования в мышах 5,6,10. В этих исследованиях внутрикамерное инъекция полистирола микрошарики, отдельно или вкомбинация с вязкоупругого материала, привело к повышение ВГД приводит к последующему RGC смерти 6,10. Тем не менее, рефлюкс, когда игла выводится из глаза и выбивании микрогранул от угла передней камеры глаза являются общими проблемами, которые возникают в ходе процедуры. Чтобы свести к минимуму эти недостатки, магниты были использованы для привлечения магнитных микрогранул к передней камеры глаза угла глаза 4,9.
Протокол , описанный здесь , представляет собой модифицированную процедура , основанная на предыдущих исследованиях 9,10 , что использует магнитные микрогранулы и ручной магнит , приспособленный к глазу мыши (рисунок 1). Несколько важных модификаций были введены в нашем протоколе для обеспечения эффективного и воспроизводимое увеличение ВГД у мышей. Во-первых, введение микрошариков осуществляется с помощью тщательно подготовленного стекла микроиглы с фацетной скоса. Полученные гладкие поверхности микроиглы, а также его заостренный кончик обеспечивает минимальное повреждениенанесен как он прокалывает роговую оболочку. Использование этой стеклянной микроиглы также приводит к повышению контроля, когда наконечник микроиглы поступает в переднюю камеру, тем самым снижая риск повреждения близлежащих структур, таких, как радужки и хрусталика. Кроме того, крошечные поражение инъекции облегчает роговицы самовосстановления и уменьшает нежелательные эффекты связаны с травмами.
Во-вторых, введение магнитных микрогранул и использование портативного магнита позволяет точно контролировать, чтобы привлечь бусинки к угол передней камеры глазного яблока в маленьком глазу мыши. Магнитные микросферы, которые были использованы 4,5 мкм в диаметре, поскольку этот размер Microbead не забивают подготовленное отверстие микроиглы и важно, когда вводили эти микросферы эффективно блокировали дренаж водянистой влаги. Такой подход не только уменьшает рефлюкс инжектированных микрогранул, но также гарантирует, что максимальное количество микрогранул накапливается в целевой области, чтобы эффективно блокировать внутриглазной жидкости дренаж. Furthermore, эта стратегия также уменьшает количество шариков, плавающих в передней камере, избегая контакта с другими структурами, такими как радужки и хрусталика, а также предотвращение прохода в заднюю камеру. В совокупности эти изменения убедитесь, что операция инъекции Microbead выполняется с относительной легкостью и своевременно, что приводит к высокой воспроизводимостью, эффективной и устойчивой индукции глазной гипертензии у мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Видео техника, представленная здесь представлены подробные шаг за шагом инструкции о том, как выполнить внутрикамерного инъекцию магнитных микрогранул эффективно и воспроизводимо вызывают повышение ВГД у мышей. Эта процедура приводит к устойчивому увеличению ВГД, которое не требует дополнительных инъекций и способствует обнаруживаемого RGC сому и потерю аксонов в течение первых 3-х недель глазной гипертензии induction.Elevated ВГД является основным фактором риска для развития глаукомы у людей. Таким образом, это является ценным мышиный глазной гипертензии-зависимой глаукомой модель, которая имеет потенциал для широкого круга применений.
Общим недостатком, связанным с инъекцией микрошариков в переднюю камеру относится к бусинка рефлюкса через месте инъекции, когда иглу вынимают, что часто приводит лишь к частичной обструкцией оттоку и повышенной изменчивости. Для решения этой проблемы, были реализованы несколько важных изменений. Елки т, тщательная подготовка чистой, острой стеклянной микроиглы с фацетной скос имеет важное значение для успешной инъекции микросфер. Правильно подготовленный микроиглы обеспечивает контролируемое и плавное проникновение роговицы с минимальным приложением давления к деликатной поверхности глазного яблока. Небольшой прокол роговицы предотвращает обратный поток микрогранул. Кроме того, штраф микроиглы снижает риск повреждения близлежащих структур, таких как радужки и хрусталика, что может привести к воспалению без заболеваний, связанных. Во-вторых, применение портативного магнита к стратегическим районам глазными во время и после инъекции является еще одним важным аспектом этой методики. Во время инъекции, магнит используется для рисования магнитные микрогранулы в переднюю камеру предотвращения рефлюкса микрошариков, когда микроиглы снимается. После инъекции магнит затем используется, чтобы направить микрогранулы к радужно-роговичный угол, чтобы блокировать отток водный юмор.
палатка "> Еще одна проблема часто встречается в моделях Microbead прикуса является то , что повторные инъекции шарик часто необходимы для достижения устойчивого ВГД до уровня 10,11. Это может быть результатом микрошариков выбивании из угла передней камеры глаза с течением времени. Сочетание карманного магнита, как описано выше, и позиционирование мыши после операции значительно улучшает результат. парентерального введения противотуберкулезных анестезирующих средств, которые обеспечивают гибкость, чтобы перемещать головку во время процедуры и требуют более длительного послеоперационного периода восстановления благоприятствуют. Размещение мышь с оперированного глаза вверх в течение нескольких часов после операции способствует урегулированию микрогранул на радужно-роговичный угол и уменьшает риск выбивании обратно в переднюю камеру.Обеспечение того, чтобы число инжектированных шариков является относительно последовательным является еще одним важным шагом на пути к минимуму вариаций между животными. Поскольку микросферы оседают на Ьottom трубки, необходимо в полной мере гомогенизации раствора Microbead и вывести соответствующий объем в микроиглы своевременно. Инъекция меньшего количества шариков в переднюю камеру может привести к неполному блокированию водянистой влаге дренажных сооружений, что может привести к плохой или переменной высоты ВГД. Следует отметить, что хотя конечной целью инъекции микрогранулами, чтобы поднять ВГД, следует соблюдать осторожность при проведении измерений ВГД от бодрствования мышей выше пиковых значений в этом исследовании (~ 25 мм рт.ст.). Чрезвычайно высокие IOPs увеличивают риск ишемического повреждения, а также может вызвать боль животному. Повышение ВГД следует рассматривать как один из многих факторов, чтобы оценить успех операции. Таким образом, результаты процедуры должна быть оценена на основе нескольких параметров, в том числе повышение ВГД, RGC смерть сомы и потери аксонов.
Хотя протокол, описанный здесь, приводит в большинстве успешных микрошариковLY оседание под углом, потенциальным недостатком этой модели является то, что эти шарики, которые остаются плавающие в передней камере может помешать живого изображения сетчатки глаза через роговицу, а также электрофизиологические или поведенческих анализов, которые требуют эффективного прохождения света. Еще один важный аспект необходимо учитывать при использовании этой модели Microbead окклюзия является то, что степень подъема ВГД и последующего перерождения RGC изменяется в зависимости от возраста и генетического фона оперируемой мыши [4]. Таким образом, степень возвышения IOP и сроки дегенерации RGC должны быть определены для каждой конкретной трансгенной линии мыши и / или возрастной диапазон.
Особенностью данной модели является то, что повышенные результаты ВГД в постепенной потере смерти RGC в течение первых трех недель после инъекции микрогранулами и значительной гибели RGC обнаруживается через 3 недели после процедуры. Следовательно, эта модель позволяет изучение ранних и / или тонкие изменения, которые происходят в этом гisease, до изобличению RGC сому и потерю аксонов. Значительное увеличение гибели RGC не наблюдалось между 3 и 6 недель после индукции глазной гипертензии. На самом деле, ГКС сома и аксон потери оставались стабильными при ~ 22 – 25%, от 3 до 6 недель, несмотря на успешное и устойчивое повышение ВГД в этих временных точках. Более длительный срок поступательному ВГД может потребоваться для дополнительной потери RGC произойти в C57BL / 6 мышей, которые , как представляется, более устойчивы к повреждениям RGC по сравнению с другими штаммами мыши. 5 Дополнительные модификации протокола , представленного здесь, включая корректировку размера шарика и дополнительные инъекции, которые могут потребоваться для изучения потери RGC в более поздние моменты времени. Таким образом, наш протокол идеально подходит для исследований, ориентированных на ранних патофизиологических изменений, которые коррелируют со скромными RGC нейродегенеративные, которые имеют отношение к возникновению и ранней прогрессии в человеческой глаукомы.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Materials
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
Referências
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neurociência. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
