磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること

以下の手順は、実験動物の使用と眼科での動物の使用とビジョンと眼科研究協会（ARVO）から視覚研究のための声明のための動物ケアに関するカナダの協議会のガイドラインに準拠して行きました。 前方房内注入のためのマイクロニードルの作製プラーと、ホウケイ酸ガラス毛細管からマイクロニードルを生成します顕微鏡下で、慎重にマイクロニードルの先端に開口部​​を作成するために、鋭い刃を使用しています。得られた開口部は、それぞれ、約190ミクロンと70ミクロンのメジャーとマイナーの軸径の楕円形状を有していなければなりません。最初の画像解析ソフトウェアを用いて定量化に続いて、顕微鏡下に置き、定規を使用して画像を取得することにより調製されたマイクロニードルの開口部の面積を測定します。 マイクロピペット面取りシステムでは、20 degreでマイクロニードルを配置面取りプレートに電子の角度マイクロニードル開口板に触れていることになります。縁が平らで滑らかになるまで約10分間ベベル。プロセスを助けるために、蒸留水を数滴加えます。 先端が鋭利になるまで開口を囲む2のエッジを面取りするマイクロニードルを回転させます。 エアゾールダスターを使用して、マイクロニードル先端開口からすべての破片や水をきれいにしてください。 慎重に顕微鏡下で完成したマイクロニードルを調べます。手術中にマイクロニードル破壊の危険性を最小限にするために骨折とマイクロニードルを捨てます。 その後、無菌の平衡塩溶液（BSS）と、エタノールで最初にリンスすることによってマイクロニードルを滅菌します。 磁気マイクロビーズソリューションの調製注：この研究で使用される磁気ビーズは、エポキシ基でコーティングされています。このようなビーズの凝集や不要な分子間相互作用などの悪影響を防止するために、これらのエポキシ基がなければなりません最初の注射の手術を続行する前に、マイクロビーズから除去されます。 磁気ビーズからのエポキシ基の除去 10倍トリス緩衝液中0.02Mの水酸化ナトリウム（NaOH、MW 39.997グラム/モル）（MW 121.14グラム/モル）の溶液を調製します。 ビーズが均一溶液中に懸濁されるまで穏やかに磁気マイクロビーズ溶液（4.5ミクロン直径、4×10 8ビーズ/ ml）のストックをボルテックス。 すぐに10×トリス緩衝液中の0.02 M NaOHを50mlに磁気ビーズ溶液1mlをピペット。 ビーズからのエポキシ基を除去するために、室温で24時間回転させます。 チューブの底に磁石を固定することにより、ビーズを収集します。すべてのビーズが磁石に引き寄せられることを保証するために、水平にチューブを向けます。 RTでさらに4時間回転させます。 マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなく、上清を除去します。 ゆっくり10倍T 50mlにペレットをボルテックスビーズをよく懸濁されるまで、RISバッファ。 繰り返しは、2.1.6に2.1.4を繰り返します。 濃度および滅菌平衡塩溶液中の磁性マイクロビーズの再懸濁 注：2.4×10 6ビーズはで前房に注入することができるように、1.6×10 6ビーズ/μlの最終濃度に達するように、滅菌平衡塩類溶液（BSS）内の磁気ビーズ溶液のストックを濃縮することが必要です小さなマウスの眼に適した1.5​​マイクロリットルの最終容量。 静かに2分間ボルテックスすることにより超高純度の実験室グレードの水5ml中でビーズを洗浄します。 磁石をチューブの底にそれらを誘致することにより、ビーズを収集します。 マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなく水を除去。 繰り返しは、2.2.1 2.2.3にさらに3回繰り返します。 層流フードでは、pipettinによってBSSの500μlのビーズを洗います上下グラム。層流フード内で無菌条件下で、このセクションの残りの手順を実行します。 磁石をチューブの底にそれらを誘致することにより、ビーズを収集します。 マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなくBSSを削除します。 繰り返しは、2.2.5 2.2.7にさらに3回繰り返します。 上下BSS250μlの中のビーズをピペッティングして再懸濁します。 ビーズ溶液を十分に均質化されることを確認してください。その後、すぐに滅菌0.5ミリリットルチューブに懸濁液25μLを分取。ストックビーズ溶液の最終濃度は1.6×10 6ビーズ/μlです。 4℃で保存。 高眼圧症の3誘導注：第3節では、2人の操作です。特定のアクションは、特定の人物によって実行される場合には、適切な人物が識別されます。人2はRであるが、一般的に、人1は、顕微鏡下でマウスを処理しマイクロシリンジポンプを操作するためのesponsible。外科処置の合計時間が10分未満であるべきである（3.17から3.9ステップ）。 大人のC57BL / 6マウスの手順を実行します。食料と水を自由摂取へのアクセス権を持つ標準的な環境でのハウスマウス。本論文では、年齢の3と4.5ヶ月の間に雌のC57BL / 6マウスを使用します。しかしながら、このプロトコルは、トランスジェニックおよびノックアウトマウスを含む雄と異なる年齢のマウス、ならびに他のマウス系統に適合させることができます。 較正されたリバウンド眼圧計を使用して前麻酔およびマイクロビーズの注入に覚醒したマウスにおいて、ベースラインIOPを測定します。角膜上プロパラカイン塩酸塩の1滴を適用します。 そっと耳の間の皮膚を保持することによって、マウスを抑えます。動物が快適で、目がアクセスできるようにベンチトップ上にマウスを置きます。角膜表面に対して垂直眼圧計を持ち、取得するために、目ごとに10個の連続測定値の少なくとも3セットを取りますIOPの平均。覚醒したマウスにおけるIOPの測定は、IOPに麻酔関連の影響を回避することが好ましいです。代替的に、IOPは、ステップ3.4の後に麻酔したマウスで測定することができます。 20 mg / mlでケタミン、2 mg / mlとキシラジン、および0.4 mg / mlでアセプロマジンで構成される株価マウスカクテル麻酔液を調製します。 カクテル混合物（体重の1μL/ g）を腹腔内投与によりマウスに麻酔を誘導します。マウスの頭部を取り扱う際には、動物が吸入マスクに接続されていないとして、それは柔軟性を可能にするため、注射用麻酔カクテルの使用は、ガス麻酔薬（ 例えば、イソフルラン）よりも好ましいです。さらに、注射麻酔薬で必要な長い回復期間は、マイクロビーズが前房内に戻って外れることなく、虹彩角膜角に落ち着くことが保証されます。 ブプレノルフィンの皮下の体重1kg当たり0.05ミリグラムを管理します。 トロピカミドのEYと目の治療電子瞳孔拡張を誘導するためにドロップします。マウスの前房のサイズが小さいため、瞳が簡単に注入中にマイクロニードルの位置決めと前進を視覚化するために拡張されなければなりません。 手順中に角膜の乾燥を避けるために、反対側の眼（非手術）に局所軟膏を適用します。 マイクロシリンジポンプの注入アセンブリにきれいなマイクロニードルを取り付けます。クロス動物の汚染を避けるために、すべての操作の後にマイクロニードルを交換してください。 人1：オペレーティング・プラットフォームに麻酔マウスを転送します。顕微鏡下で、瞳孔が完全に拡張されていること、および眼球運動がないように、眼の筋肉がリラックスしていることを確認してください。眼球運動の欠如は、注入時の安定性を確保します。ゆっくり吸収性綿棒を使用して、目からトロピカミド点眼液を拭いてください。 人2：ピペッティングにより磁気マイクロビーズ液を混ぜます。 マイクロシリンジポンプを使用して、すぐにMICRをロードoneedle均質化された磁気マイクロビーズ溶液（2.4×10 6ビーズ）の1.5μlを持つ（セクション1で調製しました）。気泡がマイクロニードルの先端に存在しないことを確認してください。マイクロニードルがロードされた後、磁気マイクロビーズ溶液が均一懸濁液中に残るように、できるだけ速やかに3.13に3.12のステップを実行します。 角膜輪部に前方に相対配置された45°の角度でロードされたマイクロニードルを、置きます。人1：プラスチック製のピンセットを用いて、目をサポートしています。マイクロニードルとプラスチックの鉗子との間の角度は約90°であることを確認してください。 人2：マイクロニードルの先端が前房に入るようにロードされたマイクロニードルを使用すると、静かに角膜を穿刺。ロードされたマイクロニードルを穿刺時の角膜縁に対して45°の角度のままでいることを確認してください。レンズやアイリスとの接触を避けてください。マイクロニードルは、房に入らないことを確認してください。人1：目のサポートを継続プラスチック製のピンセットを用いて。 人1：マウスの​​ヘッドを移動せずに、前房内に磁気ビーズを引き付け、角膜の内面とビーズの接触を最小限にするために、マイクロニードルの先端部とは反対側の目、横に磁石を配置します。人2：マイクロシリンジポンプを使用して、前房内に磁気ビーズ溶液の1.5μLを注入します。マイクロビーズ溶液を15〜30秒間かけて注入します。人1：注射の全期間中に、マイクロニードルの先端に磁石の反対を押し続け。 人2：ビーズのフルボリュームが注入された後、ゆっくりと目からマイクロニードルを撤回。人1：マイクロビーズの逆流を避けるためには、さらに30〜60秒間の横の目に磁石を保持することによって、前房に向けた磁気ビーズを魅了し続けます。 人1：磁石を使用して、虹彩角膜角にビーズを引き付けます。ビーズが均等に分布して環を形成していることを確認してください前房の周囲。このステップの間、彼らが接触した際に、角膜の内面に固執する傾向があるとして、角膜にビーズを集めて避けます。 感染のリスクを最小限に抑えるために抗生物質の点眼で操作目を扱います。 マウスが（〜3から4時間）完全に目を覚ましまで熱パッド上で回復させます。操作眼が上を向くようにマウスを置きます。この位置決めは、引力によって角膜の内面に注入されたビーズの蓄積を防ぐことができます。また、この位置は、操作目は任意の寝具および/またはケージ中に存在し得る他の材料と接触しないように、感染の可能性を減少します。必要に応じて動物が苦痛の兆候を表示する場合には、ブプレノルフィンの追加の用量を投与。 マウスはIOP測定を行う前に少なくとも2日間手順から回復することを可能にします。 3.2で説明したようにIOPを測定します。モニ器IOP少なくとも週に一度以上の頻度で、必要に応じて、その日の同じ時刻に概日関連の変動を最小限に抑えることができます。 IOP測定のために、内部コントロールとして動作し、マウスから反対側の眼を使用しています。また、無傷の、非操作または偽手術マウスのようなナイーブコントロールからの測定値を使用します。 網膜神経節細胞相馬と軸索生存4.評価直ちに氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）、続いて0.1Mリン酸緩衝液（PBS）の心臓内注入によって高眼圧症に供したマウスを灌流。 4.1で説明したように、無傷の、非操作マウスを灌流し、損傷していないコントロールとしてそれらを使用しています。損傷後の反対側の眼の変化は15,16報告されており、データの解釈を混乱させる可能性があるため操作したマウスからの反対側の眼の使用は、RGCの生存率を評価することは推奨されません。代わりに、1を注入した偽手術目を使用対照としてBSSの0.5μlの。 microscissorsを使用して、慎重に眼窩からそれを単離するために、眼の周囲の結合組織を切断します。視神経頭のレベルでそれを切断することにより、眼から視神経を区切ります。 30 G針を使用して、眼内に固定液の浸透を可能にするために、角膜に穴を作ります。 4％PFA中で目を置き、追加の固定のために4℃で1時間インキュベートします。 （MW：214グラム/モル）、2％PFAおよび0.1 Mカコジル酸ナトリウム中の2.5％グルタルアルデヒドを含む溶液中で視神経を置き、追加の固定のために4℃でO / Nインキュベートします。 5.上のRGCソーマ密度の定量フラットマウント型網膜 17次の手順では、ナダルニコラらによってプロトコルから適応され、網膜のフラットマウント上で脳特異的ホメオボックス/ POUドメインタンパク質の3A（Brn3a）に対する抗体を用いたRGCの定量化の概要を示します。注意してください。代替メタRGCを標識するためのODSは、複数のスプライシング（RBPMS）またはフルオロゴールドまたはDiIを持つ逆行性標識法とRNA結合タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学などのもを使用することができます。 解剖顕微鏡下で、角膜が簡単に外れるまで、全輪部に沿って切開を行うことで、眼の前方部分を削除します。角膜とレンズを取り外してください。慎重鋸状縁と視神経に沿ってカットを行うことで、眼から網膜を切り離します。 明らかに4網膜象限を描写するために視神経に向かって網膜の周辺部から4小等距離の切開を行うことで、網膜フラットマウントを準備します。小さなブラシを使用して、静かに網膜から残りの硝子体を除去します。できるだけ多くの硝子体液の除去は、クリーンで強力な免疫組織化学的信号を得るために重要です。 網膜になるように慎重にPBS中の0.5％トリトンX-100を含む48ウェル平底培養プレートに網膜を転送します自由に浮遊。神経節細胞層が上を向いていることを確認します。 15分間-70℃で培養プレートを置きます。 PBS中で新鮮な2％トリトンX-100で2回洗浄することにより網膜、さらに透過処理を解凍した後。 PBS、2％トリトンX-100及び2％正常ロバ血清を含有する0.5μgの/ mlの – 0.3 Brn3a抗体を希釈します。静かに4℃でO / Nを振ることによりBrn3a一次抗体溶液中で網膜をインキュベートします。網膜は、完全にすべての回で、溶液の150〜200μl中に浸漬する必要があります。 PBS、2％トリトンX-100を含有する、穏やかに振盪しながら室温で2時間この溶液中で網膜をインキュベートするとmlの2μgの/へのロバ抗ヤギIgG二次抗体を希釈します。網膜は完全にすべての回で抗体溶液に浸漬する必要があります。光退色を防止するために、残りのステップのためにアルミホイルで培養プレートをカバーしています。 組織は、POSのように平らになるようにブラシを使用して、慎重にスライドに網膜を転送sible。 10分間空気乾燥しました。抗フェードマウンティング培地を使用してマウントします。 蛍光顕微鏡下で網膜のフラットマウントを調べます。記載されているように、網膜象限ごとに3つの非重複領域にBrn3a正のRGCの数を定量化する。18 視神経断面積上のRGC軸索の6.定量ステップ4.5から視神経を収集し、2時間、2％四酸化オスミウム（のOsO 4、MW 254.23グラム/モル）でインキュベートします。 注意：その高い毒性のために、四酸化オスミウムは、適切な実験室での服装とドラフト内で処理する必要があります。 15分ごとに（50％、70％、90％、95％、および100％）エタノールの濃度を増加させ、それを浸漬することにより視神経を脱水。 、15.72ミリリットル埋め込み-812 6.45ミリリットルドデセニル無水コハク酸、7.83ミリリットルナジックメチル無水物、0.45ミリリットルDMP-30：次のレシピを使用して、エポキシ樹脂を準備します。 順次構成されるソリューションで視神経をインキュベート0：1、1：0.75：0.25と1：以下のプロピレンオキシドへのエポキシ樹脂の比（MW 58.08グラム/モル）の0。視神経は、O / Nの期間室温で各溶液中でインキュベートします。 さらに48時間、60℃で100％のエポキシ樹脂中に包埋視神経（6.4から最後のステップ）をインキュベートします。 ミクロトームを用いて半薄い視神経断面（0.75μm）を生成します。 1％トルイジンブルーで視神経断面を染色します。 19が記載されているように、各視神経節の5の非重複領域にRGC軸索を定量化します。