نظام حقن الضغط للتحقيق في الجهاز العصبي من معالجة المعلومات في استيقظ يتصرفون المكاك القرد اللحاء
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا لدينا هو موضح بالتفصيل كيفية تنفيذ الحقن موثوقة ودقيقة والتسجيلات وحيدة الخلية ذات جودة عالية مع "قبالة الجاهزة للاستخدام" نظام حقن الضغط. في حين أن هذا الأسلوب من تسليم المخدرات قد سبق استخدامها في التصرف القرود (إعادة النظر في 17)، ونظام المقدمة هنا مزاياه، استعرض أدناه.
كما هو موضح في الشكل رقم 4A، النظام المذكور هنا يمكن أن توفر قياس ثابت للنشاط الخلايا العصبية واحد مع وبدون الحقن الدوائية في المنطقة المجاورة مباشرة للموقع تسجيل. كما هو مبين في الشكل 4B، وحقن تحكم جوهر، المالحة، لا يؤدي إلى تغيير في اطلاق المعدل. توضح هذه السيطرة إلى أن عملية الحقن نفسها لديها أي تأثير ملموس على خصائص إطلاق الخلايا العصبية المسجلة.
التكوين المكاني من الخلايا العصبية، وتسجيل الكهربائي، وmicropipette هو من الأهمية أهمية في هذه التجارب. على الرغم من أن القياس الدقيق من مراكزها النسبية في الأنسجة أثناء تسجيل غير ممكن، يمكن أن نعتبر والسيطرة على المصادر المحتملة للالتباين. أولا، خلال حقن حجم هناك خطر يتمثل في أن الخلايا العصبية من الفائدة قد نزحوا بعيدا عن القطب تسجيل، مما يؤثر على استقرار الإشارات المسجلة. ولهذا السبب فإنه من الحكمة أن المقارنة بين معدل إطلاق النار قبل وبعد كتلة حقن للتحقق الاستقرار إشارة. ثانيا، تكوين دليل أنبوب من نظام تسجيل يحدد المسافة بين الأقطاب وmicropipette (على سبيل المثال، 305 ميكرون في نظام 3-قناة مركزية المستخدمة في هذه التجربة). كما يوفر نظام السيطرة على الموقف دقيقة لعمق الأقطاب وmicropipette في الأنسجة، والمسافة بينهما يمكن التقليل من معايرة بعناية عمق نسبي قبل التسجيل (الخطوة 3.5)، وابقائها على عمق مشترك خلال التسجيلات.
والأنف والحنجرة "> القيود المحتملةبالإضافة إلى مراقبة الجودة في المنزل من قبل الشركة المصنعة، يحتاج النظام ليتم التحقق من صحتها في ظل ظروف المختبر، ومختلف العلامات التجارية للأنابيب والحقن وما يمكن أن تستخدم ويمكن أن يؤدي إلى اختلافات في حجم طرد. على الرغم من أن النظام يمكن أن تستخدم لحقن كميات صغيرة جدا كما هو الحال في التجربة هو موضح هنا، وهذه هي أقل من الحد الأدنى وحدة التخزين التي يمكن التحقق من صحة بسبب القيود قياس العملية في بيئة معملية عادية. ومع ذلك، حقن كميات أكبر يمكن أن تستخدم للاستدلال على العلاقة بين حجم المعرفة من قبل البرنامج وحجم طرد من قبل الأجهزة. إذا تم استخدام أنابيب شفافة، وهو فحص بصري إضافي لعملية حقن ممكن عن طريق قياس تشريد علامة بصرية.
إدراج micropipette في النظام هو أكثر تطلبا من الإدراج الكهربائي، وقطر من micropipette أكبر قليلا والمواد أكثر هشاشة. بالإضافة الى،الانضمام إلى أنبوب إلى دبوس من micropipette يمثل تحديا لأنها تنطوي على مخاطر عالية من كسر الجزء العلوي من micropipette. ومع ذلك، فإن مدى الحياة من micropipette تحميلها بنجاح هو عدة أشهر، حتى مع الاستخدام اليومي.
في الواقع، نحن لم تواجه بعد انسداد في نظام حقن أثناء التنظيف بعد تسجيل للنظام. ومع ذلك، لا "على الانترنت" الاختيار هو ممكن، وهناك خطر من أن انسداد المادي (مثل الأنسجة في الطرف micropipette) قد يمنع حقن مادة. لذا قد يكون من المستحسن لتحليل البيانات متحفظ، مثل بما في ذلك إلا تلك الخلايا في مزيد من التحليل أن تظهر تغيرات كبيرة في اطلاق معدلات بين السيطرة وحقن كتل من التجربة.
وعلى الرغم من قطرها صغير، والميكروية والماصات محل أنسجة المخ ويمكن أن تسبب بعض تلف الأنسجة المحلية. وهذا يمكن أن يكون الحد الأدنى عن طريق وضع غيض من عشر يدوياأنابيب دليل البريد فقط فوق الأم الجافية. الأقطاب ثم اختراق الجافية ويستدل intactness من خلال قياس ممانعات على الانترنت. بعد ذلك، يتم إدراج micropipette. عند استخدام هذا الأسلوب، فمن المستحسن إزالة العادية للأنسجة فوق الجافية إلى زيادة خفض خطر الكهربائي أو ماصة الكسر.
بالمقارنة مع الطرق البديلة
النظام المستخدم هنا يظهر مزايا واضحة مقارنة مع أنظمة حقن الضغط الأخرى. ميزة واحدة قوية هي قطر من micropipette (حوالي 100 ميكرون)، وهو نصف حجم تحقيقات الأخرى المتاحة 17 وبالتالي يقلل من تلف الأنسجة العصبية. وعلى النقيض من التصاميم السابقة، ويعمل النظام الحالي يفصل مكانيا القطب تسجيل وmicropipette. على الرغم من أن أنظمة أخرى توفر مسافة صغيرة بين القطب وماصة، النظام المذكور هنا يسمح التغييرات عمق مستقلة من الأقطاب الكهربائية وماصة، وبالتالي permitting المسافات النسبية المتغيرة ضمن جلسة تسجيل. الأهم من ذلك، أي حل وسط بشأن جودة التسجيل يجب ان يتم، ونظام حقن هو امتداد لجهاز تسجيل المعمول بها. في حين يستخدم فقط micropipette واحد، وبالتالي واحدة مادة في هذا البروتوكول، فمن الممكن لحقن عدة مواد في إجراء التجارب واحد. ولتحقيق ذلك، عدة بال micropipettes يمكن الخيوط في أنابيب دليل منفصلة ومتصلة إلى الحقن التي شنت في مضخات حقن الفردية. وأخيرا، والسيطرة على نظام غير سهلة، كما هو مطلوب برنامج كمبيوتر واحد فقط لدفع الأقطاب وmicropipette، ولأداء حقن الضغط أثناء التجربة.
مقارنة حقن الضغط على الرحلان الشاردي، وهناك مزايا والعيوب النسبية. على سبيل المثال، حقن ضغط يتطلب كميات أكبر لإدخالها في الأنسجة من الرحلان الشاردي، مما يزيد من خطر النزوح الخلايا العصبية. بروتو الحالييستخدم عمود مجلدات في مجموعة NL، ونحن نادرا ما شهدت تغييرات ملحوظة في جودة الإشارة خلية سجلت في. ويتيح هذا النظام أيضا كميات أكبر ليتم حقنه، وهي مفيدة محتملة للتلاعب السلوكية ولكن يمكن أن تؤثر على استقرار تسجيل العصبية. وهناك ميزة واضحة لحقن الضغط على الرحلان الشاردي هي طائفة واسعة من المواد القابلة للاستخدام حيث لا يوجد متطلبات لاستخدام المواد المشحونة. ومع ذلك، يجب أن يتم التحقق قيم الرقم الهيدروجيني ومقارنة بين المواد التجريبية والضابطة (على سبيل المثال، مالحة).
وقد يثور سؤال لماذا لاستخدام أسلوب الراسخة الحقن الضغط بدلا من التقنيات الحديثة مثل علم البصريات الوراثي لمعالجة النشاط العصبي. على الرغم من أن راسخة في القوارض، وغير ثابتة علم البصريات الوراثي بشكل صحيح في القرود. على وجه الخصوص، فإنه لا يسمح بعد التلاعب المحلي للخلايا انتقائية لنوع ناقل عصبي معين. وعلى المدى الطويل، ونحن نرىإمكانات كبيرة لمجموعة من المزايا من التلاعب الدوائية مع مزايا التلاعب optogentic في توضيح الأساس العصبي للوظائف الإدراكية.
هنا أظهرنا كيف حقن ضغط يمكن استخدامها لمعالجة دوائيا منطقة محظورة محليا في الدماغ من مستيقظا، ويتصرف القرود. نأمل أن هذا الأسلوب يلهم علماء آخرين للتحقيق مساهمات neuromodulatory لديناميات نشاط الخلايا العصبية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث من خلال مركز التعاونية بحوث 889 "الآليات الخلوية من المعالجة الحسية" لST (مشروع C04). نشكر سينا بلومر، ليونور بورخارت، ديرك Prüsse، كلاوس Heisig ورالف Brockhausen للدعم التقني والمتعلقة بالحيوان والمتعاونين لدينا في وحدة الخلايا الجذعية في مركز الرئيسيات الألماني، الدكتور كاتارينا Debowski وآنا Magerhans، لتقديم المساعدة التقنية في عملية الترشيح.
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
Referências
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M., Johansson, H., Windhorst, U. . Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. . Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
