Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Celler dyrket innenfor CPF se noen endringer i oksygen eller karbondioksid konsentrasjoner som de beveger seg fra inkubatoren til behandling kammer mikroskop kammer og tilbake. Det er viktig at forholdene i hvert kammer er tilpasset til den spesielle kuvøse hvor cellene holdes før cellene blir fjernet fra inkubatoren. Atmosfæren i anordningen er kontinuerlig HEPA-filtrert og kan tilpasses med hensyn til oksygen og karbondioksid konsentrasjoner. Cellene kan dyrkes ved standard konsentrasjoner på pscs eller NSCs, 5% og 9%, henholdsvis; eller alternative konsentrasjoner kan velges for forskjellige celletyper eller spesifikke eksperimenter. Dermed er anordningen forsynt med konstante kilder til medisinsk kvalitet oksygen, karbondioksid og nitrogen (figur 4). Alle tre av disse gassene er levert av gass-spesifikke manifoldsystemer som sikrer konstant forsyninger. Apparatet er også forsynt med et kalibreringsgassblanding bestående av10% (± 0,01%) karbondioksyd i oksygen. De manifold-systemer er plassert utenfor cellen produksjonsanlegg og gassene føres inn i anlegget gjennom taket. Kalibrerings gass ligger innenfor innretningen. Apparatet er i tillegg forsynt med husvakuum, også gjennom taket. Ved hjelp av et elektronisk overvåkingssystem og trådløse senderenhetene, er utgangs presset fra alle manifolder konstant overvåket. I tilfelle at noen trykket faller utenfor rekkevidde, blir cellen produksjonsanlegg operatører automatisk ringte og varslet slik at nødvendige tiltak kan iverksettes.
Strømkravene til apparatet blir møtt av seks dedikerte 120 V kretser synkende fra taket og koblet til sykehusets back-up generatorer for å sikre en konstant tilførsel. Drift av apparatet styres via programvare på en PC-basert datamaskin drevet gjennom en avbruddsfri strømforsyning. Disse kraft og PC ordningersikre at systemet fungerer kontinuerlig selv i tilfelle av en offentlig makt systemsvikt. Programvaren styring av anordningen har et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (figur 1), som gir mulighet for kontroll av oksygen og karbondioksid konsentrasjoner, så vel som temperatur, fuktighet, og kammertrykk. Verdiene for alle disse parametrene blir kontinuerlig registrert for å tilveiebringe en løpende registrering av alle apparater parametere. Denne informasjonen er støttet opp på en ekstern server hver natt for å beskytte sin integritet. Datamaskinen og programvaren kan nås eksternt av administrative brukere til å vurdere og / eller endre noen parameter. I tillegg kan maskinen og programvaren hentes eksternt, slik interaktiv vurdering av apparater parametere og feilsøking med lokale brukere. En ytterligere alarmsendeenhet er koplet til anordningen, slik at celleproduksjonsanlegg operatører blir varslet om en hvilken som helst ute-av-rekkevidde tilstand av anordningen. Fjerntilgangs capabilities tillate logg inn og vurdering av detaljene i out-of-range tilstand.
Apparatet er utformet som et modulsystem både i makro- og mikro forstand. Individuelle cellekultur moduler, for eksempel kuvøser og behandlingskamre, kan tilpasses i forhold til sine dimensjoner og krav, samt i sin layout i forhold til hverandre. I tillegg er de fleste av de styrefunksjoner til de individuelle modulene er selv modulær slik at de enkelte atmosfæriske gassstyringer, for eksempel, kan lett skiftes ut uten vesentlig avbrudd i systemet.
Spesialisert behandling kamre, slik som en for mikroskopisk visualisering og manipulering av cellekulturer, kan lett tilpasses til systemet. Både fase-kontrast og fluorescens mikroskop er inne i systemet (figur 6), slik at cellene kan bli direkte farget, og kolonier kan dissekert under de samme atmosfæriske betingelser som inne than inkubatorer. Ruting av kabler gjennom forseglede maljene i sideveggene i behandlingskammeret gjør det mulig for utstyr som strømforsyning og datamaskiner å bli holdt utenfor anordningen, vanligvis på en vogn (figur 6).
Foredlings kamrene i cellen produksjonsanlegg har et annet mønster enn konvensjonelle luftstrøm BSC. I konvensjonelle BSC, strømmer luftstrømmen ned fra en sentral utløpskanal og splittes i to separate strømmer, som deretter tas opp av to forskjellige inntaksåpningene i den fremre og aktre del av kabinettets gulvet. I motsetning til dette har den CPF en enkelt ventil i den forreste del av taket. Luft strømmer nedover og mot baksiden av kammeret, hvor det blir så trukket oppover inn i en luftinntaksåpningen. Selv om CPF er i seg selv meget ren, betyr dette unike luftstrøm mønster som teknikere må justere litt sin teknikk for å redusere risikoen for forurensning. Som ved en konvensjonell BSC, en lab arbeideren should Unngå å plassere hendene oppstrøms åpne cellekulturplater og medie flasker. Imidlertid har den retning som er oppstrøms blitt endret på den CPF
Cellen produksjonsanlegg laboratorium i seg selv er ganske standard og er utstyrt med en -20 ° C fryser, en -80 ° C fryser, en 4 ° C kjøleskap, en sentrifuge, og et vannbad. Laboratoriet har også en vask med fotkontroller for praktisk håndfri betjening. For at dette laboratorium for å bli en funksjonell klinisk celle produksjonsanlegg imidlertid flere ytterligere modifikasjoner må likevel bli gjort. For det første må innretningen i seg selv bli oppgradert for å ha kapasitet til å overvåke flyktige organiske forbindelser, partikler, og konsentrasjoner av klordioksyd som brukes til rensing. For det andre, kan et behandlingskammer som inneholder en FACS maskin være plassert og koblet til resten av apparaturen via en buffermodul. Dette vil muliggjøre cellesortering og rensing av transplantable celle populasjoner under riktige miljøforhold. Til slutt, må hele anordningen rommes i en myk vegg rent rom. Dette gir en International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 miljø for apparatet fem.
Den høye sterilitet og datastyrt natur CPF gjør det til et ideelt system for fremtidige applikasjoner med cellebasert terapi og gode produksjonsprosesser. Risikoen for forurensning er sterkt dempet, men enda viktigere, er betingelsene for celle ekspansjon automatisk registrert og arkivert av datasystemet. Avvik i gasskonsentrasjoner, temperatur, fuktighet og alle arrangementer for tilgang til systemet er grundig dokumentert. Dette kan i stor grad hjelpe når undersøke produktkvalitet problemer. Det er imidlertid fremdeles begrensninger. Bruken av enhver og alle reagenser og forbruksmateriell (for eksempel mediekomponenter, pipetter, plater) må dokumenteres separat. Legg tilitionally, er det et mangfold av potensielle problemer (inkludert mange former for menneskelige feil) som kan oppstå som er fullstendig irrelevant for variablene dokumentert av CPF monitorsystem. Dermed blir behovet for høyt utdannet personell og detaljert manuell dokumentasjon av oppgaver er fortsatt på plass.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke de ansatte på Biospherix for deres hjelp i å lære å bruke Xvivo vedlagte cellekultur system, spesielt Matt Freeman; de ansatte i Miles & Kelley Construction Company, Inc. for sitt arbeid i å sette opp laboratorieinfrastruktur, spesielt Russ Hughes; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling Fasiliteter og støttetjenester for sitt arbeid med å samordne laboratoriet oppussing, spesielt Adam Lukhard og Devin Hugie; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling av informasjonssystemer for deres hjelp i å sette opp dataadministrasjon infrastruktur og fjerntilgang, spesielt Viet Tran; Barnas Hospital of Orange County ledergruppen for sin mangeårige støtte til prosjektet, spesielt Dr. Maria Minon og Brent Dethlefs. Dette arbeidet ble finansiert av Barnas Hospital of Orange County og California Institute for Regenerative Medicine gjennom tilskudd TR3-05476 til PHS. Alle forfattere bidratt likt til dette arbeidet.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |