Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Celler dyrket inden for CPF se nogen ændringer i ilt eller kuldioxid koncentrationer så de flytter fra inkubator til forarbejdning kammer til mikroskop kammer og tilbage. Det er afgørende, at forholdene i hvert kammer er tilpasset den særlige inkubator, hvor cellerne holdes inden cellerne fjernet fra inkubatoren. Atmosfæren inden i apparatet kontinuerligt HEPA-filtreret og kan tilpasses med hensyn til oxygen og carbondioxid koncentrationer. Celler kan dyrkes ved standard koncentrationer for kvikskrankerne eller NSC'er, 5% og 9%; eller alternative koncentrationer kan vælges til forskellige celletyper eller for specifikke eksperimenter. Således er apparatet forsynet med konstante kilder til medicinsk oxygen, carbondioxid og nitrogen (figur 4). Alle tre af disse gasser er leveret af gas-specifikke manifold systemer, der sikrer konstant forsyninger. Apparatet er også forsynet med en blanding kalibreringsgas bestående af10% (± 0,01%) carbondioxid i oxygen. De mangfoldige systemer er opstaldet uden for cellen produktionsanlæg og gasserne ledes ind i anlægget gennem loftet. Den kalibreringsgas har til huse i anlægget. Apparatet er yderligere forsynet med husvakuum, også gennem loftet. Ved hjælp af en elektronisk overvågningssystem og trådløst sende enheder, er output pres fra alle manifolds konstant overvåget. I tilfælde af, at enhver trykket falder uden for rækkevidde, er celle produktionsanlæg operatører automatisk ringede og meddelte således, at der kan træffes passende foranstaltninger.
De strømkrav af apparatet er opfyldt af seks dedikerede 120 V kredsløb faldende fra loftet og er forbundet med hospitalets back-up-generatorer til at sikre en konstant forsyning. Driften af apparatet styres via software på en PC-baseret computer drevet gennem en nødstrømsforsyning. Disse magt og computer Arrangementersikre, at systemet fungerer kontinuerligt selv i tilfælde af en offentlig magt systemfejl. Den software styring af apparatet har en brugervenlig grafisk grænseflade (figur 1), der giver mulighed for kontrol af ilt og kuldioxid koncentrationer såvel som temperatur, fugtighed, og kammertryk. Værdierne for alle disse parametre registreres løbende for at tilvejebringe en løbende optegnelse af alle apparater parametre. Disse data er bakket op på en ekstern server hver nat for at beskytte deres integritet. Computeren og softwaren kan fjernadgang af administrative brugere at vurdere og / eller ændre enhver parameter. Derudover kan computeren og software tilgås via fjernadgang, så interaktiv vurdering af apparater parametre og fejlfinding med lokale brugere. En ekstra alarm afsendende enhed er forbundet til apparatet, således at celle produktion facilitet erhvervsdrivende bliver gjort bekendt nogen out-of-range tilstand af apparatet. Den fjernadgang capabilities tillader logge ind og vurdere detaljerne i out-of-range tilstand.
Apparatet er udformet som et modulsystem både i en makro og en mikro forstand. Individuelle cellekultur moduler, såsom væksthuse og behandling af kamre, kan tilpasses med hensyn til deres dimensioner og krav samt i deres layout i forhold til hinanden. Derudover er de fleste af de kontrolfunktioner for de enkelte moduler er selv modulopbygget således at de enkelte atmosfæriske gas controllere, for eksempel, kan nemt udskiftes uden væsentlig forstyrrelse af systemet.
Specialiserede behandlingskamre, såsom en for mikroskopisk visualisering og manipulation af cellekulturer, der let tilpasses til systemet. Både fase-kontrast og fluorescensmikroskop er inde i systemet (figur 6), således at celler kan levende farves, og kolonier kan dissekeres i de samme atmosfæriske forhold som inde than væksthuse. Kabler gennem forseglede øskner i sidevæggene af behandlingskammeret tillader udstyr såsom strømforsyninger og computere skal holdes uden for apparatet, som regel på en vogn (figur 6).
Forarbejdningsomkostninger kamre i cellen produktionsanlæg har en anden luftstrøm mønster end konventionelle BSC. I konventionelle BSC, luftstrøm strømmer ned fra en central udstødning og deler sig i to separate strømme, som derefter optages af to forskellige luftindtagene i den forreste og bageste del af kabinettet gulv. Derimod CPF har en enkelt aftræk i den forreste del af loftet. Luft strømmer nedad og mod bagsiden af kammeret, hvor det trækkes derefter opad i en indsugning. Selv CPF er i sagens natur meget ren, denne unikke luftstrøm mønster betyder, at teknikere har til let tilpasse deres teknik til at reducere risikoen for forurening. Som med en konventionel BSC, en lab arbejdstager should Undgå at placere deres hænder opstrøms af åbne cellekultur plader og medier flasker. Men den retning, der er opstrøms er blevet ændret på CPF,
Cellen produktionsanlæg laboratorium selv er temmelig standard og er udstyret med en -20 ° C fryser, en -80 ° C fryser, en 4 ° C køleskab, en centrifuge, og et vandbad. Laboratoriet har også en vask med mund kontrol for bekvem håndfri betjening. For dette laboratorium for at blive en funktionel klinisk celle produktionsanlæg imidlertid adskillige yderligere modifikationer skal stadig foretages. For det første skal apparatet selv opgraderes til at have kapacitet til at overvåge flygtige organiske forbindelser, partikler, og koncentrationer af chlordioxid, som anvendes til dekontaminering. For det andet kan en forarbejdning kammer indeholdende en FACS maskine anbringes og forbindes til resten af apparatet via en buffer modul. Dette vil give mulighed for celle sortering og rensning af transplantable cellepopulationer under de relevante miljøforhold. Endelig skal hele apparatet skal placeres i en blød væg clean room. Dette giver en International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 miljø for apparatet fem.
Den høje sterilitet og computerstyret karakter af CPF gør det til et ideelt system til fremtidige applikationer med celle-baseret behandling og gode fremstillingsprocesser. Risikoen for forurening er væsentligt mildnet, men endnu vigtigere, er betingelserne for celleekspansion automatisk registreres og arkiveres af computersystemet. Afvigelser i gaskoncentrationer, temperatur, luftfugtighed, og alle arrangementer for adgang til systemet er strengt dokumenteret. Dette kan i høj grad hjælpe når han undersøger produktkvalitet problemer. Der er imidlertid stadig begrænsninger. Brugen af enhver og alle reagenser og forsyninger (fx medier komponenter, pipetter, plader) skal dokumenteres separat. Tilføjeitionally, er der et væld af potentielle problemer (herunder mange former for menneskelige fejl), der kan opstå som er fuldstændig uden forbindelse til de variabler, dokumenteret af CPF overvågningssystem. Således forbliver behovet for højt uddannet personale og detaljeret manual dokumentation af opgaver på plads.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende personalet på Biospherix for deres hjælp i at lære at bruge Xvivo medfølgende cellekultursystem, især Matt Freeman; de ansatte i Miles & Kelley Construction Company, Inc. for deres arbejde med at etablere laboratoriet infrastruktur, især Russ Hughes; de ansatte i Børnehospital i Orange County afdeling af Faciliteter og Support Services for deres arbejde med at koordinere laboratoriet remodel, især Adam Lukhard og Devin Hugie; de ansatte i Børnehospital i Orange County afdeling af informationssystemer for deres hjælp til at oprette den data management infrastruktur og fjernadgang, især Viet Tran; Børnenes Hospital i Orange County Executive Management Team for deres mangeårige støtte til projektet, især Dr. Maria Minon og Brent Dethlefs. Dette arbejde blev finansieret af Børns Hospital i Orange County og California Institute for regenerativ Medicine gennem tilskud TR3-05476 til PHS. Alle forfattere bidrog ligeligt til dette arbejde.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |