Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте – что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток – и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) ^1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исправить предимплантационной стадии мыши, (2) выполняет иммунофлюоресценции маркировать белки, представляющие интерес, (3) осуществляют весь монтажа изображений с помощью конфокальной микроскопии с Z-секционирования возможностей и (4) выполнить ядерной сегментацию конфокальных изображений и анализирует последующее количественное изображение. Этот трубопровод позволяет тон Несмещенные измерение уровней белка для присвоения клеточных идентичностей охарактеризовать субпопуляции клеток на месте. Этот протокол может быть осуществлена ​​в качестве лишь 3 – 4 дней в течение одного помета (как правило, до 10 эмбрионов мыши), из коллекции эмбриона к анализу данных (Фиг.1В). Одновременный анализ нескольких пометов приведет к увеличению изображения и анализа данных в реальном времени бремя, таким образом, расширяя общую длину протокола.

Эмбрион предимплантационной стадии мышь экспериментально сговорчивым система, которая, учитывая ее небольшие размеры и стереотипное морфология ^3, хорошо подходит для в целом визуализации клеточных процессов с разрешением одноклеточного. Для того чтобы осуществить объективную, системы уровня анализа статистически соответствующее количество эмбрионов, автоматизированная, количественный анализ трубопровода желательно. Тем не менее, из-за высокой плотности ядер массы внутренней клеточной (ICM) бластоцисты ( <stRong> 1А, 2D), обычные сегментация изображения платформы не в состоянии обеспечить достаточную точность, чтобы установить автоматизированную или полуавтоматическую рабочий процесс. С другой стороны, руководство сегментации, в то время как точные, не позволяет обрабатывать большие когорты клеток и эмбрионов, а также не подходит для воспроизводимой, беспристрастной определения клеточных идентичностей – что особенно важно при изучении стадий развития, где формы маркера выражение не полностью решены (например, не проявляют бинарный дистрибутив через населением). Недавно мы разработали и утверждена метод сегментации изображений специально для мыши преимплантационных эмбрионов стадии и мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), что обеспечивает высокую точность, но требует ввода минимальные пользователя ^4-8.

Трубопровод анализ, представленный здесь вращается вокруг MATLAB основе инструмента сегментации изображения Модульная Интерактивная ядерной сегментации (МИН) ^4. MINS рerforms неконтролируемого ядерного сегментацию на больших партий конфокальной Z-стеки после того как пользователь установил минимальное количество свойств изображения, используя графический пользовательский интерфейс (GUI) (таблица 1) ^4. Этот трубопровод доказала эффективность для генерации данных с высокой пропускной способностью на экспрессии белка и локализации клеток в обоих дикого типа, экспериментально обрабатывают и генетически модифицированные эмбрионы и стволовые клетки ^5-7. В настоящем протоколе, мы опишем применение минут до сегментации зародыша изображений предимплантационной стадии. Примеры исполнения минут на ESCs см ^{до 4,7.} Автоматизированная шаг ядерная сегментация позволяет значительно сократить время трудоемкости процесса идентификации ячейки, в то время как пространственные и флуоресценции измерений интенсивности позволит объективную определение клеточных идентичностей и генерацию трехмерных карт экспрессии генов доменов и положение клеток в эмбрионе (рис 1С </strong>). Кроме того, масштабируемость этого процесса делает его применимым к анализу отдельных пометов через многочисленные группы экспериментально обработанных эмбрионов или эмбрионов различных генетических фонов ^5,6. MINS находится в свободном доступе на http://katlab-tools.org (программное обеспечение требует лицензии MATLAB).

Нет подход, разработанный на сегодняшний день не позволяет генерировать такие данные углубленных на экспрессию белка и локализации клеток в мышь преимплантационных эмбрионов. Все попытки до сих пор в количественном эти типы данных были ограничены в ручном определения и количественного числа клеток для различных групп населения в зародыше (либо полностью вручную, либо программного обеспечения при содействии) ^9-19. Этот подход (включающий программное обеспечение мин) был специально для и протестирован на мышиных эмбрионов и предимплантационной ESCs; Тем не менее его производительность на других системах с высокой плотностью ядерной, хотя еще не проверялось, как ожидается, будет эквивалентна.