CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese

Der Großteil der biologischen Prozesse innerhalb einer Zelle passiert sind gedacht , durch Proteinanordnungen statt ¹ einzelne Proteine ​​durchgeführt werden. Folglich, um die spezifische biologische Rolle einer Protein – Untereinheit in einer Zelle zu erläutern ist es notwendig , seine strukturelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Liganden in den Komplexen ² zu verstehen. Allerdings Proteine ​​nativ zu studieren, die Aufrechterhaltung ihrer nicht-kovalente Wechselwirkungen und Aktivität, bleibt eine Herausforderung. Einer der Nachteile von nativem Protein Studien ist eine geeignete einheimische Trenntechnik, die mit verschiedenen Downstream-Protein-Analyse-Techniken kompatibel ist. Aus diesem Grund hat scharf ³ aktuelle Interesse an der Trenntechniken fähig zur Charakterisierung nicht-kovalente Baugruppen von Biomolekülen erhöht.

Protein-Trenntechniken sind unerlässlich, Biochemie, Biophysik und verschiedene andere Studien. Aktuelle nativen Trenntechniken haben intrinsic Mängel, die die Kompatibilität mit Downstream-Analysen, wie niedrige Auflösung, geringem Durchsatz, Verlust an Niederschlag, und die Anforderung von großen Mengen an Ausgangsprobe zu reduzieren. Tandem Affinitätsreinigung wird für die Proteininteraktionsstudien allgemein verwendet, aber es muss separat für jedes Protein Target durchgeführt, wodurch es ⁴ inkompatibel mit Hochdurchsatz – Analyse. Grßenausschlußchromatographie ^5, selektive Fällung mit Ionen – Affinitätschromatographie ⁵ und Dichtegradienttrennmittel ⁶ alle nativen Trennungen zur Verfügung gestellt haben, sind aber von Natur aus niedrig auflösenden Techniken und erfordern hohe Anfangsprobenmengen.

Alternativ Gelbasis Techniken, wie Blue Native (BN) und Clear Native (CN) PAGE (entweder 1-D oder 2-D), zeigen hochauflösende Trennung. Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Techniken erwähnt, beide native PAGE Trennungen halten Löslichkeit und nativer Konformation eines breiten range von Makromolekül-Spezies, einschließlich hydrophobe Proteine. Diese Fähigkeit erweitert ferner die Proteom Abdeckung durch diese Verfahren erreicht ^7,8 und wird durch unterschiedliche Chemie zwischen CN und BN-PAGE erreicht. CN-PAGE setzt häufig auf weichen geladene Reinigungsmittel als Trägermoleküle, die Coomassie-Blau-Farbstoff in BN-PAGE zu ersetzen. BN-PAGE, wenn auch mit einer höheren Auflösung verbunden sind , hat Vorbehalte wie reduzierte enzymatische Aktivität in den getrennten Proteine ^​​8 und Adduktbildung Coomassie Molekül, wobei letztere stark abträglich nachgelagerten MS wird analysiert ^9. Beide Verfahren sind traditionell jedoch in Verbindung mit niedrigen Erholung und schmalen Proteom Abdeckung aufgrund der Färbung und -Gelextraktions Einschränkungen ^7.

Für die Studie von denaturierten Proteinen, gibt es mehrere Techniken, die Makro Löslichkeit aufrechtzuerhalten, während hochauflösende Fraktionierung mit hohem Proteinwiederherstellung durchführen und dass sind kompatibel mit diVerse Nachabscheidung Proteinanalysetechniken. Geleluiert flüssige Fraktion Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) ist eine der Fraktionierungstechniken, die alle diese Eigenschaften passen. Dieses Verfahren wird in Hochdurchsatz-top-down Proteomstudien weitgehend angewendet, was darauf hinweist, dass es schnell und vielseitig ist. In GELFrEE, Proteine ​​denaturiert und getrennt werden bezogen auf das Molekulargewicht durch eine röhrenförmige Gel-Matrix kann die Porosität von denen basierend auf Probe Anforderungen und den gewünschten Fraktionierung Ergebnisse variiert werden. Die Fraktionen werden in der flüssigen Phase eluiert, wodurch die Erholung Einschränkungen reduziert mit SDS-PAGE assoziiert, während eine hohe Auflösung. Die Fraktion Aliquots können dann durch 1-D PAGE für Molekulargewicht Bandbreite Auswahl ¹¹ analysiert werden. Es besteht eine hohe Nachfrage nach den mit GELFrEE verbundenen Vorteile in nativen Trenntechniken. Das hier beschriebene Verfahren, löschen Mutter GELFrEE (CN-GELFrEE), ist eine native Bearbeitung von GELFrEE. Um mit einem breiten s kompatibel zu seinpectrum von Makromolekülen in ihrem nativen Zustand stützt sich dieses Verfahren nicht nur auf dem weichen CN-PAGE Chemie, sondern auch auf einem Porositätsgradienten Trennung, die durch Eliminieren des harten Übergang zwischen Porositäten in diskontinuierlichen Gelsystemen ⁹ Proteinpräzipitation reduziert. Bei Anwendung auf Proteinkomplexe, extrahiert aus Maus Herz fraktionieren, angezeigt eluierten Fraktionen hohe Rückgewinnung und eine hochauflösende Trennung von einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhalten wurde. Ferner sind die resultierenden Fraktionen kompatibel mit den meisten nachgelagerten biochemischen und biophysikalischen Protein analysiert.