Summary

CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese

Published: February 29, 2016
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Summary

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

Abstract

Protein-Komplexe führen eine Reihe von entscheidenden zellulären Funktionen. Aufklären ihre nicht-kovalente Wechselwirkungen und Dynamik ist von größter Bedeutung für das Verständnis der Rolle der Komplexe in biologischen Systemen. Während die direkte Charakterisierung biomolekularer Baugruppen zunehmend in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat, einheimische Fraktionierung Techniken, die mit Techniken Downstream-Analyse kompatibel sind, einschließlich der Massenspektrometrie, sind notwendig, um weiter diese Studien erweitern. Dennoch fehlt das Feld einen hohen Durchsatz, Weitbereichs, High-Recovery-Trennverfahren für native Protein Baugruppen. Hier präsentieren wir klare nativen geleluiert flüssige Fraktion Einklemmung Elektrophorese (CN-GELFrEE), das ist eine neue Trennmethode für nicht-kovalente Protein-Baugruppen. CN-GELFrEE Trennleistung wurde durch Fraktionierung Komplexe aus Mäuseherzen extrahiert demonstriert. Die Fraktionen wurden über 2 Stunden gesammelt und angezeigt im Bereich diskrete Banden von ~ 30 bis 500 kDa. A congängige Muster Molekulargewicht Bandbreiten der Erhöhung beobachtet, jeweils im Bereich ~ 100 kDa. Ferner zeigte anschließende Re-Analyse von nativen Fraktionen über SDS-PAGE Molekulargewicht mit der Denaturierung von Proteinkomplexen konsistent verschiebt. Daher wurde CN-GELFrEE erwies sich die Fähigkeit zur Durchführung hochauflösenden und hoch Recovery nativen Trennungen auf Proteinkomplexe aus einem großen Molekulargewichtsbereich zu bieten, Fraktionen bieten, die mit kompatibel sind Downstream-Protein analysiert.

Introduction

Der Großteil der biologischen Prozesse innerhalb einer Zelle passiert sind gedacht , durch Proteinanordnungen statt 1 einzelne Proteine ​​durchgeführt werden. Folglich, um die spezifische biologische Rolle einer Protein – Untereinheit in einer Zelle zu erläutern ist es notwendig , seine strukturelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Liganden in den Komplexen 2 zu verstehen. Allerdings Proteine ​​nativ zu studieren, die Aufrechterhaltung ihrer nicht-kovalente Wechselwirkungen und Aktivität, bleibt eine Herausforderung. Einer der Nachteile von nativem Protein Studien ist eine geeignete einheimische Trenntechnik, die mit verschiedenen Downstream-Protein-Analyse-Techniken kompatibel ist. Aus diesem Grund hat scharf 3 aktuelle Interesse an der Trenntechniken fähig zur Charakterisierung nicht-kovalente Baugruppen von Biomolekülen erhöht.

Protein-Trenntechniken sind unerlässlich, Biochemie, Biophysik und verschiedene andere Studien. Aktuelle nativen Trenntechniken haben intrinsic Mängel, die die Kompatibilität mit Downstream-Analysen, wie niedrige Auflösung, geringem Durchsatz, Verlust an Niederschlag, und die Anforderung von großen Mengen an Ausgangsprobe zu reduzieren. Tandem Affinitätsreinigung wird für die Proteininteraktionsstudien allgemein verwendet, aber es muss separat für jedes Protein Target durchgeführt, wodurch es 4 inkompatibel mit Hochdurchsatz – Analyse. Grßenausschlußchromatographie 5, selektive Fällung mit Ionen – Affinitätschromatographie 5 und Dichtegradienttrennmittel 6 alle nativen Trennungen zur Verfügung gestellt haben, sind aber von Natur aus niedrig auflösenden Techniken und erfordern hohe Anfangsprobenmengen.

Alternativ Gelbasis Techniken, wie Blue Native (BN) und Clear Native (CN) PAGE (entweder 1-D oder 2-D), zeigen hochauflösende Trennung. Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Techniken erwähnt, beide native PAGE Trennungen halten Löslichkeit und nativer Konformation eines breiten range von Makromolekül-Spezies, einschließlich hydrophobe Proteine. Diese Fähigkeit erweitert ferner die Proteom Abdeckung durch diese Verfahren erreicht 7,8 und wird durch unterschiedliche Chemie zwischen CN und BN-PAGE erreicht. CN-PAGE setzt häufig auf weichen geladene Reinigungsmittel als Trägermoleküle, die Coomassie-Blau-Farbstoff in BN-PAGE zu ersetzen. BN-PAGE, wenn auch mit einer höheren Auflösung verbunden sind , hat Vorbehalte wie reduzierte enzymatische Aktivität in den getrennten Proteine ​​8 und Adduktbildung Coomassie Molekül, wobei letztere stark abträglich nachgelagerten MS wird analysiert 9. Beide Verfahren sind traditionell jedoch in Verbindung mit niedrigen Erholung und schmalen Proteom Abdeckung aufgrund der Färbung und -Gelextraktions Einschränkungen 7.

Für die Studie von denaturierten Proteinen, gibt es mehrere Techniken, die Makro Löslichkeit aufrechtzuerhalten, während hochauflösende Fraktionierung mit hohem Proteinwiederherstellung durchführen und dass sind kompatibel mit diVerse Nachabscheidung Proteinanalysetechniken. Geleluiert flüssige Fraktion Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) ist eine der Fraktionierungstechniken, die alle diese Eigenschaften passen. Dieses Verfahren wird in Hochdurchsatz-top-down Proteomstudien weitgehend angewendet, was darauf hinweist, dass es schnell und vielseitig ist. In GELFrEE, Proteine ​​denaturiert und getrennt werden bezogen auf das Molekulargewicht durch eine röhrenförmige Gel-Matrix kann die Porosität von denen basierend auf Probe Anforderungen und den gewünschten Fraktionierung Ergebnisse variiert werden. Die Fraktionen werden in der flüssigen Phase eluiert, wodurch die Erholung Einschränkungen reduziert mit SDS-PAGE assoziiert, während eine hohe Auflösung. Die Fraktion Aliquots können dann durch 1-D PAGE für Molekulargewicht Bandbreite Auswahl 11 analysiert werden. Es besteht eine hohe Nachfrage nach den mit GELFrEE verbundenen Vorteile in nativen Trenntechniken. Das hier beschriebene Verfahren, löschen Mutter GELFrEE (CN-GELFrEE), ist eine native Bearbeitung von GELFrEE. Um mit einem breiten s kompatibel zu seinpectrum von Makromolekülen in ihrem nativen Zustand stützt sich dieses Verfahren nicht nur auf dem weichen CN-PAGE Chemie, sondern auch auf einem Porositätsgradienten Trennung, die durch Eliminieren des harten Übergang zwischen Porositäten in diskontinuierlichen Gelsystemen 9 Proteinpräzipitation reduziert. Bei Anwendung auf Proteinkomplexe, extrahiert aus Maus Herz fraktionieren, angezeigt eluierten Fraktionen hohe Rückgewinnung und eine hochauflösende Trennung von einem breiten Bereich von Molekulargewichten erhalten wurde. Ferner sind die resultierenden Fraktionen kompatibel mit den meisten nachgelagerten biochemischen und biophysikalischen Protein analysiert.

Protocol

Hinweis: Dieses Video – Protokoll basiert auf einer zugehörigen Veröffentlichung 9. Spezifische Reagenzien, Material und Ausrüstung notwendig, alle Schritte in diesem Protokoll beschriebenen Aufgaben werden in der Materialien aufgeführt. Die Rezepte und Informationen für die Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. 1. Gießen von Gradient Röhrchengele Montage des Gießsystem Mit einem flamm erhitzt Rasier…

Representative Results

200 & mgr; g Proteine ​​aus kryogen gemahlener Mäuseherzen extrahiert wurden jeweils mit dem CN-GELFrEE Verfahren in einem 1-12% T Gelrohr nativ in 14 Fraktionen von 150 & mgr; l fraktioniert. Eine aliquote Menge von 10 ul jeder Fraktion auf einer CN-PAGE Flachgel und mit Silber gefärbt wurde durchgeführt. Eine klare Darstellung der Fraktionierung und Auflösung erhalten mit CN-GELFrEE Fraktionierung ist in 2A gezeigt. Fraktionen wurden über zwei Stunden …

Discussion

CN-GELFrEE wird aus der klaren Mutter (CN) PAGE – Puffersystem abgeleitet , die eine Mischung aus anionischen und neutralen Reinigungsmitteln als Trägermoleküle 9 für molekulargewichtsabhängige Proteinfraktionierung durch eine Gelmatrix verwendet. Die Anwendung des CN-GELFrEE zu einer nativen Maus Herz Proteinextrakt erzeugt geringe Komplexität Fraktionen mit diskreten Bandbreiten unter Beibehaltung nicht-kovalente Wechselwirkungen von Biomolekülen Baugruppen. Vergleich der Fraktionen zwischen CN-PAGE u…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die WM Keck-Stiftung großzügig Mittel für diese Arbeit. Dieses Material basiert auf der Arbeit von Grant FAPERJ Forschung unterstützt 100,039 / 2014 von der Regierung von Bundesstaat Rio de Janeiro – Brasilien für RDM, Wissenschaft ohne Grenzen Stipendium 88888,075416 / 2013-00 von der Koordination zur Verbesserung der Hochschulpersonal, unter der Regierung die National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Kameradschaft Nummer 2014171659 für OSS und durch CNPq Forschungsstipendium 202011 / 2012-7 von der Regierung von Brasilien für LHFDVPCH von Brasilien, für HSS, ist ein Empfänger einer der Northwestern University Chemie der Lebensprozesse Institut Postdoctoral Fellowship Award.

Materials

Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Name Company Catalog Number Comments
Materials
15 mL conical tube Any supplier n/a
30-kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 mL Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

Referências

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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE – Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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