Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

Interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte dei processi biologici, da intracellulare trasduzione del segnale di morte cellulare ^1. Quindi, il targeting PPI è di fondamentale importanza per la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. PPI possono essere regolate da anticorpi specifici e stabili, ma anticorpi sono costosi e difficili da produrre e hanno scarsa biodisponibilità. In alternativa, PPI possono essere bersaglio di piccole molecole. Piccole molecole sono più facili da sintetizzare e poco costoso rispetto agli anticorpi; tuttavia, sono relativamente meno flessibili e si adattano meglio piccole cavità di grandi interfacce proteina-proteina ^2,3. Diversi studi hanno dimostrato che i peptidi, che sono più semplici e meno costosi rispetto agli anticorpi e più flessibile di piccole molecole, possono legarsi interfacce proteine ​​e regolare PPI ^4,5. Il mercato globale peptide terapeutico è stata valutata una quindicina di miliardi di dollari nel 2013 ed è in crescita del 10,5% annually ^6. Inoltre, ci sono più di 50 peptidi commercializzati, circa 270 peptidi in diverse fasi di sperimentazione clinica, e circa 400 peptidi in fase preclinica avanzate ^7. Sebbene numerosi peptidi vengono utilizzati come farmaci, peptidi pongono ancora diverse sfide che limitano la loro applicazione diffusa tra cui scarsa biodisponibilità e la stabilità, l'inefficienza nelle membrane cellulari di attraversamento, e la flessibilità conformazionale ^8,9. Una alternativa per superare questi inconvenienti è applicare diverse modifiche come (D-amminoacido e N-alchilazione) locale e globale (ciclizzazione) vincoli ^8,10-12. Queste modifiche si verificano anche in natura. Ad esempio, ciclosporina A, un peptide ciclico naturale immunosoppressore, contiene un singolo D-amminoacido e subisce N-alchilazione modifiche ^13,14.

Modifica di aminoacidi naturali per indurre vincoli locali, come D- e N-alchilazione, spesso colpisce il peptide9; s attività biologica. Tuttavia, ciclizzazione, in cui la sequenza di interesse può rimanere lo stesso, è più probabile per preservare l'attività biologica. Ciclizzazione è un modo molto attraente per restringere peptide spazio conformazionale riducendo l'equilibrio tra le diverse conformazioni. Di solito aumenta l'attività biologica e selettività limitando il peptide alla conformazione attiva che media una sola funzione. Ciclizzazione migliora anche la stabilità peptide mantenendo il peptide in una conformazione che è meno riconosciuto da enzimi di degradazione. Infatti, peptidi ciclici hanno dimostrato di aver migliorato la stabilità metabolica, la biodisponibilità, e la selettività rispetto ai loro omologhi lineari ^15-17.

Tuttavia, ciclizzazione può essere un'arma a doppio taglio poiché in alcuni casi la restrizione può impedire che i peptidi di raggiungere una conformazione bioattiva. Per superare questo ostacolo, una biblioteca focalizzato in cui tutti i peptidi hanno lo stesso SEQUENC primarioe di conseguenza costanti pharmacophores possono essere sintetizzati. Peptidi nella libreria differiscono parametri che influenzano la loro struttura, come la dimensione e la posizione dell'anello, in modo da schermare successivamente per la conformazione più bioattivo ^9,18.

I peptidi possono essere sintetizzati sia in soluzione e da un approccio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS), che ora è il metodo più diffuso sintesi peptidica e sarà discusso ulteriormente. SPPS è un processo mediante il quale trasformazioni chimiche vengono eseguite su un supporto solido tramite un linker per preparare una vasta gamma di composti sintetici ^19. SPPS consente assemblaggio peptidi di accoppiamento consecutivo di aminoacidi in modo graduale dal C-terminale, che è attaccato ad un supporto solido, al N-terminale. Le catene laterali di acido N-alfa-ammino devono essere mascherati con gruppi protettivi che sono stabili nelle condizioni di reazione utilizzate durante peptide allungamento per garantire l'aggiunta di un amminoacido per step. Nella fase finale, il peptide viene rilasciato dalla resina e la catena laterale gruppi protettori sono contemporaneamente rimossi. Mentre il peptide viene sintetizzato, tutti i reagenti solubili possono essere rimossi dal peptide-solido matrice di supporto per filtrazione e lavato via alla fine di ogni fase di accoppiamento. Con tale sistema, un grande eccesso di reagenti ad alta concentrazione può guidare reazioni di accoppiamento a completamento e tutti i passaggi di sintesi può essere effettuato nello stesso recipiente senza trasferimento di materiale ^20.

Sebbene SPPS ha alcune limitazioni, quali la produzione di reazioni incomplete, reazioni collaterali, reagenti impuri, nonché difficoltà di controllo della reazione ^21, i vantaggi di SPPS hanno reso il "gold standard" per la sintesi peptidica. Questi vantaggi includono la possibilità di incorporare amminoacidi non naturali, automazione, facile purificazione, perdite fisiche minimizzate, e l'uso di reagenti in eccesso, con conseguentealti rendimenti. SPPS ha dimostrato di essere estremamente utile nella sintesi di sequenze difficili ^21,22, modifiche fluorescenti ^23, e librerie peptidiche ^24,25. SPPS è anche molto utile per altri assembly poli-chain, come oligonucleotidi ^{26,27, 28,29,} oligosaccaridi e peptide acidi nucleici ^30,31. È interessante notare che, in alcuni casi, SPPS ha dimostrato di essere vantaggioso per sintetizzare piccole molecole che sono tradizionalmente realizzati in soluzione ^32,33. SFF è utilizzato sia in piccola scala per la ricerca e l'insegnamento ^34,35, così come su larga scala nel settore industriale ^36-38.

Due strategie di sintesi che sono utilizzati principalmente nella metodologia SPPS per la sintesi di peptidi sono butilossicarbonile (Boc) e 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La strategia originale introdotte per SPPS era Boc, che richiede condizioni di acidi forti per rimuovere catena laterale gruppi protettori e fendere il peptide dal rEsin. Sintesi peptidica Fmoc-based utilizza tuttavia moderate condizioni di base ed è un mite alternativa al protocollo Boc acido labile ^39. La strategia Fmoc utilizza ortogonale t-butile (tBu) Protezione catena laterale che viene rimosso nell'ultimo passaggio della sintesi mentre fende il peptide dalla resina in condizioni acide.

Il principio generale per la sintesi peptidica su supporto solido è presentato de Figura 1. L'aminoacido iniziale, mascherato da un gruppo di protezione temporanea sul N-α-terminale, viene caricato sulla resina dal C-terminale. Un gruppo protettivo semipermanente per mascherare la catena laterale è anche utilizzato se necessario (Figura 1, Passaggio 1). La sintesi del peptide bersaglio viene assemblato dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo N-α-temporaneo (Figura 1, fase 2) e accoppiamento del successivo amminoacido protetto (Figura 1 </str ong>, punto 3). Dopo l'ultimo aminoacido viene caricato (Figura 1, fase 4), il peptide viene scissa dal supporto di resina e dei gruppi protettivi semi-permanenti sono rimossi (Figura 1, fase 5).

Figura 1. Schema generale di sintesi in fase solida del peptide. L'amminoacido N-α-protetto viene ancorato con il gruppo carbossilico tramite un linker alla resina (Passaggio 1). Il peptide desiderato viene assemblata in modo lineare dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo temporaneo (TPG) dal N-α (Fase 2) e accoppiamento aminoacido (Passaggio 3). Dopo realizzare la sintesi (passo 4), i gruppi protettori semipermanenti (SPG) sono deprotetto durante peptide clivaggio (Fase 5).ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo il montaggio della catena peptidica completa, ciclizzazione può essere ottenuto mediante diverse alternative: (A) testa-coda ciclizzazione – questo è un modo conveniente ma limitato in quanto fornisce una sola opzione per ciclizzazione (Figura 2A), (B) ciclizzazione utilizzando gli aminoacidi della sequenza di interesse che contengono gruppi funzionali bioattive – tuttavia, l'uso di questi aminoacidi può influenzare l'attività biologica (Figura 2B), e (C) ciclizzazione aggiungendo aminoacidi (o altri blocchi) senza disturbare la sequenza bioattivo. Introducendo queste molecole è diffuso in quanto consente produzione di librerie focalizzate senza modificare la sequenza di interesse (Figura 2C).

FIGURA 2. strategie peptide Alternativa ciclizzazione (A) testa-coda ciclizzazione, attraverso un legame peptidico tra il C-terminale e N-terminale.; (B) ciclizzazione tra i gruppi funzionali come un legame disolfuro tra i residui di cisteina (1), o un legame ammidico tra le catene laterali di lisina per acido aspartico / glutammico (2), o catena laterale di N- o C-terminale (3 -4); (C) ciclizzazione con l'aggiunta di amminoacidi extra o derivati ​​degli aminoacidi o piccole molecole, ad esempio prima (R0) e dopo (R7) la sequenza bioattivo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Micro-onde sintesi utilizza irradiazione a microonde per riscaldare le reazioni, accelerando così chimico organico trasformazioni ^40,41. Microonde chimica è basata sulla capacità del reagente / solvente per assorbire ilforno a microonde di energia e convertirla in calore ^42. Prima che la tecnologia è diventata diffusa, grossi inconvenienti dovuti superare, compresa la controllabilità e la riproducibilità dei protocolli di sintesi e la mancanza di sistemi disponibili temperatura e di pressione adeguati controlli ^43,44. La prima relazione di micro-onde sintesi peptidica è stato fatto utilizzando un forno a microonde cucina per sintetizzare diversi peptidi brevi (7-10 aminoacidi), con un significativo miglioramento della efficienza di accoppiamento e la purezza ^45. Inoltre, l'energia a microonde ha dimostrato di diminuire aggregazione catena, ridurre le reazioni collaterali, limitare racemizzazione, e migliorare i tassi di accoppiamento, che sono tutti critici per difficili e lunghe sequenze ^46-53.

Attualmente l'uso di irradiazione con microonde per la sintesi di peptidi o composti correlati su un supporto solido è ampia, tra cui (a) Sintesi di acqua invece di solvente organico ^54; (B) sintesi di peptidi concomuni modificazioni post-traduzionali, come glicopeptidi ^55-58 o ^59-61 phosphopeptides, la cui sintesi è tipicamente difficile a causa della bassa efficienza di accoppiamento di derivati ​​amminoacidici stericamente impediti; (C) sintesi di peptidi con modifica del backbone, come azapeptides, che possono essere costituiti dalla sostituzione del C (α) di un residuo amminoacidico con un atomo di azoto ^62, o peptoids, la cui catena laterale è collegato al azoto ammidico piuttosto che l'atomo Cα ^63,64; (D) sintesi di peptidi ciclici ^65-71; e (E) sintesi di librerie combinatoriali ^51,72. In molti casi, gli autori hanno riportato una maggiore efficienza e ridotto tempo di sintesi usando irradiazione a microonde rispetto al protocollo convenzionale.

Utilizzando un design razionale ^73-75, abbiamo sviluppato peptidi anti-parassiti che sono stati ottenuti da recettore L del eishmania ponteggio FOattivato r C-chinasi (mancanza). MANCANZA svolge un ruolo importante nella fase precoce dell'infezione Leishmania ^76. Parassiti che esprimono bassi livelli di MANCANZA riescono a parassitare anche topi immunocompromessi ⁷⁷ la mancanza è coinvolta nei processi parassita segnalazione essenziali e sintesi proteica ^78. Pertanto, MANCANZA è una proteina impalcatura chiave ^{79 e} un altro obiettivo prezioso. Concentrarsi sulle sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel mammifero ospite omologo RACK, abbiamo identificato un peptide 8 aminoacidi (RNGQCQRK) che è diminuita di Leishmania sp. Vitalità nella cultura.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di peptidi ciclici backbone derivati ​​dalla sequenza proteica LACK sopra descritta. I peptidi sono stati sintetizzati su un supporto solido mediante riscaldamento a microonde dalla metodologia SPPS con protocollo Fmoc / tBu. I peptidi sono stati coniugati ad un TAT _47-57 (YGRKKRRQRRR) carrier peptidico attraverso un legame ammidico comeparte del SPPS. Trasporti con sede a TAT di una varietà di carichi nelle cellule è stato utilizzato da oltre 15 anni e la consegna della merce in organuli subcellulari è stato confermato ^80. Quattro differenti linker, succinico e anidride glutarica nonché adipico e acido pimelico, sono stati usati per eseguire la ciclizzazione di generare linkers acidi carbossilici da due a cinque atomi di carbonio. Ciclizzazione è stato fatto utilizzando l'energia a microonde, e la scissione e della catena laterale fasi finali deprotezione sono stati fatti a mano, senza l'energia a microonde. L'uso di un sintetizzatore automatizzato microonde migliorato la purezza del prodotto, aumentato la resa del prodotto, e ha ridotto la durata della sintesi. Questo protocollo generale può essere applicato ad altri studi che utilizzano peptidi comprendere importante meccanismo molecolare in vitro e in vivo e sviluppare ulteriormente potenziali farmaci per malattie umane.