L'objectif principal de cet article est de démontrer l'imagerie optique de l'évolution des potentiels de membrane in vitro utilisant des protéines fluorescentes codées génétiquement. changements d'imagerie du potentiel de membrane offre la possibilité intéressante de l'étude de l'activité des circuits neuronaux. Lorsque des changements dans la membrane résultat potentiel à un changement d'intensité de fluorescence, chaque pixel de la caméra devient une électrode de substitution permettant des mesures non intrusives de l'activité neuronale. Depuis plus de quarante ans, des colorants sensibles à la tension organiques ont été utiles pour observer les changements de potentiel ^1-4 membrane. Cependant, ces colorants manquent de spécificité cellulaire. En outre, certains types de cellules sont difficiles à teindre. indicateurs de tension génétiquement codés (GeViS) à surmonter ces limitations en ayant les cellules à étudier spécifiquement expriment la sonde fluorescente sensible à la tension.

Il existe trois classes de GeViS. La première classe de GEVI utilise la vodomaine de la phosphatase de détection de tension nsion détection soit avec une seule protéine fluorescente (FP) ^5-9 ou un transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) paire ^10-12. La seconde catégorie de capteurs utilise microbienne rhodopsine comme un indicateur fluorescent directement ou par l'intermédiaire ^{de 13 à 15} FRET électrochrome ^16,17. La troisième classe utilise deux composantes, la composante génétique étant une membrane ancrée FP et un second composant étant une membrane lié trempe colorant ^18-20. Tandis que les deuxième et troisième catégories sont utiles pour in vitro et trancher les expériences ^19,20, seule la première classe de capteurs sont actuellement utile pour des analyses in vivo ^6.

Dans ce rapport, nous allons démontrer l'imagerie du potentiel de membrane en utilisant la première classe de GeViS (Figure 1) in vitro. Cette première classe de capteurs de tension est le plus facile de faire la transition à l'imagerie in vivo. Depuis GeViS utilizing un domaine de détection de tension fusionné à un FP sont environ 50 fois plus brillante que la classe de rhodopsine de capteurs, ils peuvent être imagés en utilisant un éclairage à lampe à arc au lieu d'exiger un laser extrêmement puissant. Une autre conséquence de l'écart de brillance qui est la première classe de GeViS peut facilement dépasser l'auto-fluorescence du cerveau. Les sondes à base de rhodopsine ne peut pas. La troisième classe de capteur est tout aussi brillante que la première catégorie, mais nécessite l'ajout d'un extincteur chimique qui est difficile à administrer in vivo.

Nous allons donc démontrer l'acquisition d'une sonde avec une seule FP (Bongwoori) ⁸ et une sonde constituée d'une paire de FRET (Nabi 2) ^12. Le FRET construit dans le présent rapport sont des versions de papillon de VSFP-CR (protéines fluorescentes sensibles à la tension – Clover-mRuby2) ¹¹ consistant en un donneur fluorescente verte, Clover, et un accepteur de fluorescence rouge, mRuby2, nommé Nabi 2.242 et 2.244 Nabi <sjusqu'à> 12. L'introduction de ces types d'enregistrements devrait permettre aux chercheurs de mieux comprendre le type de GeViS d'information peut fournir.

Figure 1. Deux types d'indicateurs codés génétiquement tension (GeViS) imagés dans le présent rapport (A) A __gVirt_NP_NN_NNPS<__ FP mono GEVI base ayant un domaine de détection de tension trans-membrane et une protéine fluorescente. (B) Un GEVI base de FRET composé d'un domaine de détection de tension trans-membrane, un donneur de FRET et l'accepteur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.